Экспертиза белков, связанных с ДНК находятся в стадии становления в клетках млекопитающих, используя BrdU-чип-Slot-Западная Техника
Summary
In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.
Abstract
Гистондезацетилаз 1 и 2 (HDAC1,2) локализуются в местах репликации ДНК. В предыдущем исследовании, используя селективный ингибитор и генетическую систему нокдаун, мы показали новые функции для HDAC1,2 в репликации прогрессии вилкой и зарождающейся обслуживания хроматина в клетках млекопитающих. Кроме того, мы использовали технику BrdU-чип-Slot-Западный, который сочетает хроматина иммунопреципитацию (чип) в бром-дезоксиуридина (BrdU), меченным ДНК с игрового блоттинга и Западной анализирует количественно измерить белки или модификацию гистонов, связанные с зарождающейся ДНК.
Активно делящиеся клетки обрабатывали селективного ингибитора HDAC1,2 или трансфицировали киРНК против Hdac1 и HDAC2, а затем вновь синтезированный ДНК метили с аналог тимидина бромдезоксиуридина (BrdU). BrdU маркировки было сделано в момент времени, когда не было никакого значительного клеточного цикла или апоптоз из-за потери функций HDAC1,2. После лabeling клеток с BrdU, иммунопреципитация хроматина (чип) ацетилирования гистонов марок или хроматина Remodeler была выполнена со специфическими антителами. BrdU-меченых ДНК вход и иммунопреципитировали (или ChIPed) ДНК затем наносили на мембрану с использованием метода слот-блоттинга и обездвижен с помощью УФ. Количество ДНК возникающей в каждом слоте затем количественно оценивали с помощью Вестерн-анализа с анти-BrdU антителами. Эффект потери HDAC1,2 функций на уровне вновь синтезированных ДНК-ассоциированных ацетилирование гистонов знаков и хроматина Remodeler Затем определяли путем нормализации сигнала BrdU-чипе, полученный из обработанных образцов на контрольных образцах.
Introduction
Неисправный репарации ДНК и / или репликация ДНК являются основной причиной нестабильности генома, которые могут вызвать гибель клеток. Один без ремонта двойной брейк прядь достаточно, чтобы вызвать гибель клеток 1. Хроматина организация временно изменены во время репликации как и ремонт 2,3, и неспособность поддерживать эпигенетической информации во время этих процессов приведет к угрозе целостности генома. Потеря HDAC3 или функции HDAC1,2 препятствует S-фазе прогрессирования, репликацию ДНК и ремонт, ведущий к генотоксичного стресса (повреждение ДНК) и гибели клеток 4-9. Таким образом, это практично использовать стратегию ингибиторы HDAC селективные нарушить репликации, ремонт и хроматин в раковых клетках и вызывают повреждение ДНК, что в свою очередь может остановить рост и индукции гибели клеток избирательно в быстро растущих раковых клеток.
Во время репликации ДНК, хроматин быстро разобрали, а затем собраны следующие дублирования ДНК. Недавно SYnthesized гистона Н4 ацетилированный в K5 и K12 остатков (H4K5K12ac) и после осаждения на хроматина, они быстро деацетилируется по гистондезацетилаз (HDACs) 10,11. Отказ клеток для поддержания целостности зарождающегося хроматина гистона дезацетилирования может привести к краху вилкой, которая в свою очередь может привести к повреждению ДНК и гибели клеток. Мы недавно показали, что селективное ингибирование HDAC1,2 увеличивает ацетилирование гистонов (H4K5ac, H4K12ac и H4K16ac) и ингибирует SMARCA5 хроматина Remodeler деятельность на зарождающейся хроматина, которая коррелирует с уменьшением прогрессирования вилкой репликации, увеличение вилки крах и увеличение репликации стресс-индуцированной повреждение ДНК 6 , Таким образом, обработка ингибитором HDAC может изменить зарождающийся структуру хроматина, чтобы вызвать повреждение ДНК и смерть очень быстро в раковых клетках, так как эти клетки цикла быстро и многократно проходить через S-фазе. Поэтому важно, чтобы понять, как функционируют HDACs регулировать ацетилирование гистонов и белка биндинг поддерживать репликацию ДНК в клетках млекопитающих.
Для количественного измерения количества ацетилирования гистонов и SMARCA5 хроматина Remodeler, связанной с зарождающейся ДНК во время репликации ДНК, мы разработали модифицированный чип анализ называется BrdU-чип-слот-западный технику. После иммунопреципитации хроматина (чип) желаемого белка или модификации гистонов, количество возникающей ДНК (обозначенный с помощью аналог тимидина, BrdU) в образце чип может быть обнаружен с помощью Вестерн-анализа с BrdU-меченых ДНК-чип переносили на мембрану с использованием щелевой Клякса аппарат. Используя эту технику, мы показали, что H4K16ac (отметка участвует в хроматина упаковки) и член ISWI семьи SMARCA5 (SWI / SNF, связанных с матрицей-ассоциированной актина-зависимой регулятором хроматина) хроматина перемодельер связаны с возникающей ДНК в S-фазе клеток 6. Мы также обнаружили, что зарождающаяся H4K16ac знак деацетилируется по HDAC1,2 во время репликации ДНК 6. H4K16ac ингибируетхроматина перемодельер деятельность члена семьи ISWI SMARCA5 12. Отсюда, используя технику BrdU-ЧИП-Slot-Западный, мы могли бы соединить функции для HDAC1,2 в регулировании ремоделирования хроматина во время репликации ДНК. Следовательно, методика BrdU-чип-слот-Вестерн-блот является мощным подход для количественного измерения динамики ассоциации и диссоциации белков или их пост-трансляционных модификаций, которые связаны с нарождающейся ДНК.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный в этой рукописи является относительно быстрым способом, чтобы продемонстрировать наличие белков или их посттрансляционно модифицированных форм на новореплицированные или возникающей ДНК. Кроме того, этот метод позволяет возможность измерять ассоциации-диссоциа…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа в этой рукописи была поддержана за счет средств кафедры радиационной онкологии и Huntsman института рака и Национального института здравоохранения (грант R01-CA188520) в SB. Я благодарю Danielle Джонсон и Стивен Беннетт в моей лаборатории для демонстрации и объяснения протокол свои преимущества. Я благодарен доктору Махеш Чандрасекхаран (Охотник института рака) за критические замечания по рукописи.
Materials
| Anti-BrdU (westerns) | BD Biosciences | B555627 | |
| Anti-SMARCA5 | Abcam | ab3749 | |
| Anti-H4K16ac | Active Motif | 39167 | |
| Zeta-Probe GT Membrane | Bio-Rad | 162-0197 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Protein A agarose | Millipore | 16-156 | |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma | P4850 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | |
| Rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma | S-3014 | |
| Triton-X-100 | Sigma | 93443 | |
| NP40 | USB Corporation | 19628 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S-4019 | |
| Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| Tris | Fisher | BP-152-5 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| SDS | Ambion | AM9820 | |
| Sodium hydroxide | Mallinckrodt GenAR | MAL7772-06 | |
| 20X SSC | Life Technologies | 15557-036 | |
| Non-fat dry milk | Lab Scientific Inc | M0841 | |
| ECL | Thermo Fisher | 80196 | |
| X-ray film | Genesee Sci | 30-101 | |
| Developer | Konica Minolta | SRX-101A | |
| UV Crosslinker | Stratagene | XLE-1000 | |
| Sonicator | Branson Sonifier Digital Ultrasonic Cell Disruptor | Model: 450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Model: 5810R | |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | Model: 2322 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | ThermoScientific | Model: 1000 | |
| Slot Blot apparatus | Schleicher and Schuell Minifold II | 44-27570 | |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators |
Referenzen
- Podhorecka, M., Skladanowski, A., & Bozko, P. H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy. J nucleic acids. 2010 (2010).
- Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., & Almouzni, G. Chromatin challenges during DNA replication and repair. Cell. 128, 721-733 (2007).
- Demeret, C., Vassetzky, Y., & Mechali, M. Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains. Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).
- Bhaskara, S. et al. Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control. Mol Cell. 30, 61-72 (2008).
- Bhaskara, S., & Hiebert, S. W. Role for histone deacetylase 3 in maintenance of genome stability. Cell Cycle. 10, 727-728 (2011).
- Bhaskara, S. et al. Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression. Epigenetics Chromatin. 6, 27 (2013).
- Bhaskara, S. et al. Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability. Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).
- Johnson, D. P. et al. HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma. Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).
- Bhaskara, S. Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers. Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).
- Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., & Almouzni, G. Duplication and maintenance of heterochromatin domains. J Cell Biol. 147, 1153-1166 (1999).
- Alabert, C., & Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 153-167 (2012).
- Clapier, C. R., & Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492, 280-284 (2012).
- Sirbu, B. M. et al. Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks. Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).
