BrdUでのChIP-スロット西洋技術を用いて哺乳動物細胞中で新生DNAに結合したタンパク質の検討
Summary
In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.
Abstract
ヒストンデアセチラーゼ1と2（HDAC1,2）は、DNA複製の部位に局在化します。以前の研究では、選択的阻害剤や遺伝子ノックダウンシステムを使用して、我々は複製フォークの進行および哺乳動物細胞における発生期のクロマチン維持にHDAC1,2のための新規な機能を示しました。さらに、当社は、スロットブロットでブロモデオキシウリジン（BrdUの）標識DNAのクロマチン免疫沈降（チップ）を組み合わせた、西洋を定量的に発生期のDNAに関連するタンパク質やヒストン修飾を測定するために分析したBrdU・チップ・スロット西洋技術を使用していました。
活発に分裂する細胞がHDAC1,2選択的阻害剤で処理されたか、HDAC1とHDAC2に対するsiRNAをトランスフェクトし、その後、新たに合成されたDNAはチミジンアナログブロモデオキシウリジン（BrdUの）で標識したました。有意な細胞周期停止またはHDAC1,2機能の喪失によるアポトーシスが存在しない場合は、BrdU標識の時点で行いました。続いリットルBrdUで細胞をabeling、ヒストンアセチル化マークまたはクロマチンremodelerのクロマチン免疫沈降（チップ）は、特異的抗体を用いて行きました。 BrdUで標識された入力DNA及び免疫沈降（またはChIPed）次に、DNAをスロットブロット法を用いて膜上にスポットし、UVを使用して固定化しました。各スロット内の新生DNAの量を定量的に抗BrdU抗体を用いてウエスタン分析を用いて評価しました。新たに合成されたDNAに関連するヒストンのアセチル化とクロマチンマークremodelerのレベルにHDAC1,2機能の損失の影響は、その後、対照サンプルに処理されたサンプルから得られたBrdUチップ信号を正規化することによって決定しました。
Introduction
欠陥のあるDNA修復および/またはDNAの複製は、細胞死を引き起こすことができ、ゲノムの不安定性の主要な原因です。単一の未修復の二本鎖切断は、細胞死の1を引き起こすのに十分です。クロマチン組織は一過性複製および修復2,3の両方中に変更され、これらのプロセスの間にエピジェネティックな情報を維持するために失敗は整合性をゲノムに対する脅威になります。 HDAC3またはHDAC1,2機能の喪失は、遺伝毒性ストレス（DNA損傷）および細胞死をもたらす4-9 S期の進行、DNA複製および修復を妨げます。したがって、癌細胞において複製、修復およびクロマチンを崩壊し、順番に成長を止めることができ、急速に成長する癌細胞において選択的に細胞死を誘導するDNA損傷を引き起こすために選択的HDAC阻害剤を使用する実用的な戦略です。
DNA複製時には、クロマチンは急速に分解され、その後のDNA複製次再組み立て。新しくSYnthesizedヒストンH4がクロマチン上にK5とK12残基（H4K5K12ac）、以下の堆積でアセチル化され、それらは急速にヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）10,11によって脱アセチル化されています。ヒストン脱アセチル化により新生クロマチンの完全性を維持するために、細胞の障害は、次に、DNA損傷および細胞死をもたらすことができ、フォークの崩壊をもたらすことができます。我々は最近、HDAC1,2の選択的阻害が増加し、ヒストンアセチル化（H4K5ac、H4K12acとH4K16ac）と減少した複製フォークの進行と相関する初期のクロマチン、上SMARCA5クロマチンremodeler活性を阻害することが示されたフォークの崩壊を増加させ、複製ストレスによって誘導されるDNA損傷6を増加します。したがって、HDAC阻害剤治療は、急速に、これらの細胞サイクルとして、癌細胞中で非常に迅速にDNA損傷および死を誘発し、S期を通して何度も通過する新生クロマチン構造を変化させることができます。これは、HDACはヒストンアセチル化とタンパク質ビンディを規制するように機能する方法を理解することが重要ですNGは、哺乳動物細胞におけるDNAの複製を維持します。
定量的にDNA複製時に発生期のDNAに関連するヒストンアセチル化とSMARCA5クロマチンremodelerの量を測定するために、我々は、変更されたChIPアッセイを考案したBrdU・チップ・スロット西洋技術と呼ばれます。所望のタンパク質またはヒストン修飾のクロマチン免疫沈降（チップ）以下、チップサンプルにおける（チミジンアナログのBrdUを用いて標識）新生DNAの量は、スロットを使用して膜上に移したBrdU標識のChIP DNAのウェスタン分析を用いて検出することができますブロット装置。この技術を用いて、我々はH4K16ac（クロマチンパッケージングに関与マーク）とISWIファミリーメンバーSMARCA5（クロマチンのSWI / SNF関連マトリックス関連アクチン依存調節因子）クロマチンremodelerは、S期細胞における発生期のDNAと関連していることが示されました6。我々はまた、新生H4K16acマークがDNA複製6中HDAC1,2によって脱アセチル化されることがわかりました。 H4K16acの阻害ISWIファミリーメンバーSMARCA5 12のクロマチンremodeler活動。したがって、BrdUを-CHIP-スロット西洋の技術を用いて、我々は、DNA複製の際にクロマチンリモデリングの調節にHDAC1,2ための機能を接続することもできます。したがって、BrdUでのChIP-スロットウエスタンブロット法は、定量的に発生期のDNAに結合しているタンパク質またはそれらの翻訳後修飾の会合および解離のダイナミクスを測定するための強力なアプローチです。
Protocol
Representative Results
Discussion
この原稿に記載されているプロトコルは、新たに複製または新生DNA上のタンパク質またはそれらの翻訳後修飾された形態の存在を実証するために、比較的迅速な方法です。さらに、この技術は、タンパク質又は新生DNAとその改変体の会合、解離速度を測定するために1つを可能にします。この技術は、エレガントiPOND技術13に相補的です。 iPOND技術では、新たに合成されたDNAは、エチル…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この原稿での作業は、放射線腫瘍学科とハンツマン癌研究所とSBに健康補助金の国立研究所（R01-CA188520）からの資金によってサポートされていました。私はプロトコルを実証し、その利点を説明するための私の研究室でのダニエル・ジョンソンやスティーブン・ベネットに感謝します。私は原稿の批判的なコメント博士マヘシュChandrasekharan（ハンツマン癌研究所）に感謝しています。
Materials
| Anti-BrdU (westerns) | BD Biosciences | B555627 | |
| Anti-SMARCA5 | Abcam | ab3749 | |
| Anti-H4K16ac | Active Motif | 39167 | |
| Zeta-Probe GT Membrane | Bio-Rad | 162-0197 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Protein A agarose | Millipore | 16-156 | |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma | P4850 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | |
| Rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma | S-3014 | |
| Triton-X-100 | Sigma | 93443 | |
| NP40 | USB Corporation | 19628 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S-4019 | |
| Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| Tris | Fisher | BP-152-5 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| SDS | Ambion | AM9820 | |
| Sodium hydroxide | Mallinckrodt GenAR | MAL7772-06 | |
| 20X SSC | Life Technologies | 15557-036 | |
| Non-fat dry milk | Lab Scientific Inc | M0841 | |
| ECL | Thermo Fisher | 80196 | |
| X-ray film | Genesee Sci | 30-101 | |
| Developer | Konica Minolta | SRX-101A | |
| UV Crosslinker | Stratagene | XLE-1000 | |
| Sonicator | Branson Sonifier Digital Ultrasonic Cell Disruptor | Model: 450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Model: 5810R | |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | Model: 2322 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | ThermoScientific | Model: 1000 | |
| Slot Blot apparatus | Schleicher and Schuell Minifold II | 44-27570 | |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators |
Referenzen
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