Esame di proteine legate al DNA Nascente in cellule di mammifero utilizzando la tecnica BrdU-chip-Slot-occidentale
Summary
In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.
Abstract
Istone deacetilasi 1 e 2 (HDAC1,2) localizzano ai siti di replicazione del DNA. Nello studio precedente, utilizzando un inibitore selettivo e di un sistema atterramento genetica, abbiamo dimostrato le funzioni nuovi per HDAC1,2 nella progressione della forcella replica e nascente manutenzione cromatina in cellule di mammifero. Inoltre, abbiamo utilizzato una tecnica BrdU-chip-Slot-occidentale che combina immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di bromo-deossiuridina (BrdU) DNA -labeled con macchia slot e occidentale analisi per misurare quantitativamente proteine o modificazione degli istoni associati con il DNA nascente.
Attivamente cellule in divisione sono state trattate con HDAC1,2 inibitore selettivo o trasfettate con siRNA contro HDAC1 e HDAC2 e quindi il DNA di nuova sintesi è stato etichettato con il bromodeossiuridina timidina analogico (BrdU). L'etichettatura BrdU è stata fatta in un punto di tempo in cui non c'era significativo arresto del ciclo cellulare o apoptosi a causa della perdita delle funzioni HDAC1,2. Seguendo lAbeling di cellule con BrdU, immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di marchi di acetilazione degli istoni o la cromatina-remodeler è stata effettuata con anticorpi specifici. BrdU marcato DNA ingresso e l'immunoprecipitato (o chip) DNA è stato poi trasferite su una membrana con la tecnica di slot blot ed immobilizzati mediante UV. La quantità di DNA nascente in ciascuno slot è stata poi valutata quantitativamente mediante analisi Western con un anticorpo anti-BrdU. L'effetto della perdita di funzioni HDAC1,2 sui livelli di nuova sintesi degli istoni marchi acetilazione DNA associate e cromatina remodeler è stato quindi determinato normalizzando il segnale di BrdU-Chip ottenute dai campioni trattati ai campioni di controllo.
Introduction
Riparazione del DNA difettosa e / o replicazione del DNA sono una delle principali cause di instabilità genomica, che può innescare la morte cellulare. Un singolo non riparato doppia interruzione filo è sufficiente a causare la morte delle cellule 1. Organizzazione della cromatina è transitoriamente alterata sia in fase di replica e riparare 2,3, e l'incapacità di mantenere le informazioni epigenetiche nel corso di questi processi si tradurrà in una minaccia per l'integrità del genoma. Perdita di HDAC3 o della funzione HDAC1,2 impedisce progressione fase S, la replicazione e riparazione del DNA che porta a stress genotossico (danni al DNA) e la morte delle cellule 4-9. Si tratta quindi di una strategia pratica per usare inibitori HDAC selettivi di interrompere la replica, la riparazione e la cromatina in cellule tumorali e causare danni al DNA, che a sua volta può fermare la crescita e induce la morte cellulare selettivamente nelle cellule tumorali in rapida crescita.
Durante la replicazione del DNA, cromatina è rapidamente smontato e poi rimontato seguendo duplicazione del DNA. Recentemente synthesized istone H4 è acetilato a K5 e residui K12 (H4K5K12ac) e segue la deposizione sulla cromatina, sono rapidamente deacetilata da istone deacetilasi (HDAC) 10,11. Fallimento di cellule per mantenere l'integrità della cromatina nascente da istoni deacetilazione può portare al collasso della forcella, che a sua volta può causare danni al DNA e la morte cellulare. Abbiamo recentemente dimostrato che l'inibizione selettiva di HDAC1,2 aumenta l'acetilazione degli istoni (H4K5ac, H4K12ac e H4K16ac) e inibisce l'attività SMARCA5 cromatina remodeler sulla cromatina nascente, che correla con una ridotta progressione forca di replicazione, aumentato crollo forchetta e aumentato la replica da stress danno al DNA 6 . Così, HDAC inibitore trattamento possono alterare la struttura della cromatina nascente per innescare danni al DNA e la morte molto rapidamente nelle cellule tumorali, in quanto questi ciclo cellule in rapida e passare più volte attraverso la fase S. E 'quindi importante capire come funzionano HDAC regolare acetilazione degli istoni e proteine binding per mantenere la replicazione del DNA nelle cellule di mammifero.
Per misurare quantitativamente la quantità di acetilazione degli istoni e SMARCA5 remodeler cromatina associata con il DNA nascente durante la replicazione del DNA, abbiamo ideato un saggio ChIP modificato chiamato la tecnica di BrdU-Chip-Slot-occidentale. Dopo immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di una proteina o istone modifica desiderata, la quantità di DNA nascente (all'etichetta analogico timidina, BrdU) nel campione chip può essere rilevato mediante analisi Western di DNA chip BrdU marcato trasferite su una membrana utilizzando un Slot Apparecchio Blot. Utilizzando questa tecnica, abbiamo dimostrato che H4K16ac (un marchio coinvolta nella confezione cromatina) e il membro della famiglia ISWI SMARCA5 (regolatore actina-dipendente matrice associata SWI / SNF-correlata della cromatina) remodeler cromatina sono associati con il DNA nascente in cellule in fase S. 6. Abbiamo anche trovato che il marchio nascente H4K16ac è deacetilata da HDAC1,2 durante la replicazione del DNA 6. Inibisce H4K16acattività remodeler cromatina del familiare ISWI SMARCA5 12. Quindi, utilizzando la tecnica BrdU-CHIP-Slot-occidentale, potremmo collegare le funzioni per HDAC1,2 nel regolare il rimodellamento della cromatina durante la replicazione del DNA. Quindi, la tecnica BrdU-Chip-Slot-Western Blot è un approccio efficace per misurare quantitativamente l'associazione e dissociazione dinamica delle proteine o loro modificazioni post-traslazionali che sono tenuti al DNA nascente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto in questo manoscritto è un metodo relativamente veloce per dimostrare la presenza di proteine o loro forme post-traduzionali modificati sul DNA appena replicato o nascente. Inoltre, questa tecnica permette uno per misurare la cinetica di associazione-dissociazione di una proteina o la sua forma modificata con il DNA nascente. Questa tecnica è complementare alla elegante tecnologia iPOND 13. Nella tecnologia iPOND, il DNA di nuova sintesi è etichettato con deossiuridina etile (…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro in questo manoscritto è stato sostenuto da fondi del Dipartimento di Radioterapia Oncologica e Huntsman Cancer Institute e il National Institute of Health sovvenzione (R01-CA188520) di SB. Ringrazio Danielle Johnson e Steven Bennett nel mio laboratorio per dimostrare il protocollo e spiegando i suoi benefici. Sono grato al Dr. Mahesh Chandrasekharan (Huntsman Cancer Institute) per i commenti critici sul manoscritto.
Materials
| Anti-BrdU (westerns) | BD Biosciences | B555627 | |
| Anti-SMARCA5 | Abcam | ab3749 | |
| Anti-H4K16ac | Active Motif | 39167 | |
| Zeta-Probe GT Membrane | Bio-Rad | 162-0197 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Protein A agarose | Millipore | 16-156 | |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma | P4850 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | |
| Rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma | S-3014 | |
| Triton-X-100 | Sigma | 93443 | |
| NP40 | USB Corporation | 19628 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S-4019 | |
| Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| Tris | Fisher | BP-152-5 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| SDS | Ambion | AM9820 | |
| Sodium hydroxide | Mallinckrodt GenAR | MAL7772-06 | |
| 20X SSC | Life Technologies | 15557-036 | |
| Non-fat dry milk | Lab Scientific Inc | M0841 | |
| ECL | Thermo Fisher | 80196 | |
| X-ray film | Genesee Sci | 30-101 | |
| Developer | Konica Minolta | SRX-101A | |
| UV Crosslinker | Stratagene | XLE-1000 | |
| Sonicator | Branson Sonifier Digital Ultrasonic Cell Disruptor | Model: 450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Model: 5810R | |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | Model: 2322 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | ThermoScientific | Model: 1000 | |
| Slot Blot apparatus | Schleicher and Schuell Minifold II | 44-27570 | |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators |
Referenzen
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