Coloration immunofluorescente in situ de l'autophagie dans les cellules souches musculaires
Summary
L'autophagie active est associée à la régénération musculaire productive, ce qui est essentiel pour l'activation des cellules souches musculaires (MuSC). Ici, nous fournissons un protocole pour la détection in situ de LC3, un marqueur autophagique dans les muSCs MyoD-positives de sections de tissu musculaire à partir de souris témoins et blessées.
Abstract
La preuve croissante indique que l'autophagie est un processus de réglementation crucial pour préserver l'homéostasie des tissus. On sait que l'autophagie est impliquée dans le développement et la régénération du muscle squelettique, et le processus autophagique a été décrit dans plusieurs pathologies musculaires et des troubles musculaires liés à l'âge. Un bloc récemment décrit du processus autophagique qui est en corrélation avec l'épuisement fonctionnel des cellules satellites pendant la réparation musculaire confirme l'idée que l'autophagie active est couplée à la régénération musculaire productive. Ces données révèlent le rôle crucial de l'autophagie dans l'activation des cellules satellites pendant la régénération musculaire dans des conditions normales et pathologiques telles que les dystrophies musculaires. Ici, nous fournissons un protocole pour surveiller le processus autophagique dans le compartiment de cellules souches musculaires adultes (MUSC) pendant les conditions de régénération musculaire. Ce protocole décrit la méthodologie d'installation pour effectuer une imagerie immunofluorescence in situ de LC3, et uneMarqueur d'utophagie et MyoD, un marqueur de lignée myogénique, dans des sections de tissus musculaires du contrôle et des souris blessées. La méthodologie déclarée permet de surveiller le processus autophagique dans un compartiment cellulaire spécifique, le compartiment MuSC, qui joue un rôle central dans l'orchestration de la régénération musculaire.
Introduction
La régénération du muscle squelettique est le résultat de l'interaction entre les cellules souches adultes (Cellules satellites musculaires, MuSC) et d'autres types de cellules impliquées dans le processus de régénération. L'homéostasie musculaire et la fonctionnalité sont maintenues par les signaux combinés découlant de la niche musculaire et des indices systémiques 1 , 2 . Tout au long de la vie, des changements dans la fonctionnalité MuSC, le niche musculaire et les indices systémiques ont été rapportés, entraînant le déclin des capacités fonctionnelles chez les personnes âgées 3 . Les MuSC sont placés dans une niche sous la lame basale et, lors d'une blessure musculaire, sont activés pour réparer les muscles endommagés 4 , 5 . Afin d'assurer une réponse régénératrice productive, il est essentiel que les MUSC coordonnent les différents processus nécessaires à la sortie de la quiescence, de l'auto-renouvellement et de l'expansion proliférative.Par la différenciation myogénique 6 . Chez les personnes âgées et dans les maladies chroniques musculaires, toutes ces fonctions sont compromises, entraînant une altération de la fonctionnalité musculaire 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .
La macroatophagie (appelée ci-après autophagie) apparaît comme un processus biologique crucial essentiel pour préserver l'homéostasie des tissus 14 . Le processus autophagique englobe les mécanismes de traite, où des portions de cytoplasme, d'organelles et de protéines sont englouties dans des vésicules qui se dégradent éventuellement via la voie du lysosome, favorisant l'élimination des molécules toxiques et le recyclage du macromoleCules. Cela fournit des composés riches en énergie pour soutenir l'adaptation des cellules et des tissus sous contrainte ou d'autres conditions défavorables 15 , 16 . Avec l'activité de survie cellulaire, l'autophagie peut également fonctionner comme inducteur de la mort cellulaire, selon le contexte du tissu cellulaire ( p. Ex. Tissu normal versus cancer) et le type de stimulus de stress 17 , 18 .
Des preuves récentes indiquent que l'autophagie est nécessaire pour maintenir la masse musculaire et l'intégrité de la myofibre 19 , 20 et a été signalée comme étant altérée dans différentes dystrophies musculaires 21 , 22 , 23 , y compris la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 </suP> , 28 , 29 , 30. De même, une réduction progressive du processus autophagique a été observée chez les personnes âgées 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , après une perte de masse musculaire (appelée sarcopénie) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , et dans la survie de myofibres 38 .
Une relation étroite entre l'autophagie et le potentiel régénérateur des muscles squelettiques a été anticipée par une étude du laboratoire de Wagers, qui a montré qu'une restriction calorique améliore la disponibilité et l'activité de MuSC 39 . C'est nonLa nouvelle observation a été confirmée par l'observation récente selon laquelle l'axe Foxo3-Notch active le processus autophagique pendant l'auto-renouvellement 40 et la transition MuSC de l'état de repos à l'état de prolifération 41 . Ces données concordent avec la réduction progressive de l'autophagie basale de jeunes et anciens et de MuSCs gériatriques, en association avec le déclin numérique et fonctionnel des MuSC pendant le vieillissement 42 .
Dans un article récent, nous avons démontré une relation étroite entre l'autophagie et la régénération musculaire compensatoire qui distingue les premiers stades de la progression de la DMD. En conséquence, nous avons observé un flux autophagique réduit aux stades ultérieurs de la progression de la maladie, lorsque la régénération musculaire est compromise et que le dépôt de tissu fibrotique se produit. D'une manière intrigante, nous avons montré que, dans les conditions de régénération, l'autophagie est activée dans les MUSC et que la modulation du processus autophagique affecte l'activation de MuSC et fuNationality 30 .
Dans l'ensemble, ces données mettent en évidence l'urgence d'explorer le processus autophagique dans les MUSC pendant la régénération musculaire dans des conditions normales et pathologiques et tout au long de la vie. Ici, nous fournissons un protocole pour surveiller le processus autophagique dans MuSC dans les conditions de régénération musculaire en effectuant l'immunocoloration in situ pour la protéine 1A / 1B-chaîne légère 3 (LC3) associée aux microtubules, un marqueur de l'autophagie 43 et MyoD, un marqueur de Lignée myogénique, dans les sections de tissu musculaire du contrôle et des souris blessées. La méthodologie déclarée permet de surveiller le processus autophagique dans un compartiment cellulaire spécifique, le MuSC, qui joue un rôle clé dans l'orchestration de la régénération musculaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit comment surveiller l'autophagie dans les cellules souches du muscle squelettique pendant la régénération musculaire compensatoire. Plusieurs anticorps pour la co-coloration de LC3 et MyoD ont été essayés, et ceux qui travaillent dans des sections de tissus de souris et créent des résultats réussis sont listés ici (voir la Table des matériaux ). La perméabilisation avec le méthanol (voir étape 3.2.2) est fortement recommandée pour une coloration réussie. </p…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par NIAMS AR064873, Epigen Project PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT à LL
Materials
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0,5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt – Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO – Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
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