Otofajinin Kas Hücrelerinde Yerinde İmmunofloresan Boyanması
Summary
Aktif otofaji, Kas Kök Hücresi (MuSC) aktivasyonu için gerekli olan üretken kas rejenerasyonu ile ilişkilidir. Burada, LC3'ün in situ tespiti için bir protokol sunuyoruz, kontrol ve yaralı farelerdeki kas dokusu bölümlerinin MyoD pozitif MuSC'lerinde bir otofaji markörü.
Abstract
Artan kanıtlar, doku homeostazını korumak için önemli bir düzenleyici süreç olarak otofajiye işaret ediyor. Otofajinin iskelet kası gelişiminde ve yenilenmesinde rol aldığı bilinmektedir ve otofajik süreç birkaç kas patolojisinde ve yaşla ilgili kas bozukluklarında tanımlanmıştır. Otofajik işlemin kısa bir süre önce açıklanan, kas onarımında uydu hücrelerinin işlevsel tükenişiyle ilişkili olan bloğu, aktif otofajinin üretken kas rejenerasyonu ile birleştiğini desteklemektedir. Bu veriler, kas distrofileri gibi hem normal hem de patolojik koşullarda kas rejenerasyonu sırasında uydu hücresinin aktivasyonunda otofajinin önemli rolünü ortaya çıkarmaktadır. Burada, kas rejeneratif koşulları sırasında yetişkin Kas Hücresi (MuSC) bölmesindeki otofajik süreci izlemek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol LC3'ün in situ immünofloresans görüntülemesini gerçekleştirmek için kurulum metodolojisini açıklamaktadır.Utofagy markeri ve MyoD, miyojenik soy işaretleyicisini, kontrol ve hasar gören farelerdeki kas dokusu kesitleri içinde göstermektedir. Bildirilen metodoloji, kas rejenerasyonunun düzenlenmesinde merkezi bir rol oynayan bir özel hücre bölmesindeki MuSC bölmesindeki otofajik prosedürün izlenmesine izin verir.
Introduction
İskelet kası rejenerasyonu, yetişkin kök hücreler (Kas Uydu Hücreleri, MuSCs) ve rejeneratif süreçte yer alan diğer hücre tipleri arasındaki etkileşimin bir sonucudur. Kasların homeostazı ve işlevselliği, kas nişinden ve sistemik ipuçlarından 1 , 2 oluşan kombine sinyaller tarafından sağlanır. Yaşam boyu MuSC işlevselliği, kas nişindeki değişiklikler ve sistemik ipuçları bildirildi ve yaşlılarda fonksiyonel kapasitelerin azalmasına neden oldu3. MuSC'ler bazal tabakanın altında bir niş halinde bulunur ve kas hasarına bağlı olarak hasar görmüş kasları onarmak için harekete geçirilir 4 , 5 . Üretken bir rejeneratif tepki sağlamak için, MuSC'lerin sessizliğe, kendi kendini yenilemeye ve proliferatif genişleme aşaması için gerekli olan farklı süreçleri koordine etmeleri çok önemlidirMiyojenik farklılaşma ile 6 . Yaşlılarda ve kas kronik hastalıklarında, bu işlevlerin tümüyle tehlikeye girer ve kas işlevlerinde değişikliklere yol açar 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .
Macroautophagy (bundan böyle otofaji olarak anılacaktır), doku homeostazını korumak için hayati bir biyolojik süreç olarak ortaya çıkmaktadır14. Otofajik süreç, sitoplazmanın, organellerin ve proteinlerin kısımlarının sonunda lizozom yolu ile bozunduğu toksik moleküllerin çıkarılmasını ve makromolefin geri dönüşümünü teşvik eden kaçakçılık mekanizmalarını kapsarcules. Bu, stres veya diğer olumsuz koşullar altında hücre ve doku adaptasyonunu desteklemek için enerji açısından zengin bileşikler sağlar 15 , 16 . Otofajy, hücre sağkalımı aktivitesi ile birlikte, hücre dokusu bağlamına ( örn. Kanser dokusuna karşı normal) ve stres uyarımının tipine ( 17 , 18 ) bağlı olarak bir hücre ölüm indüksiyonu olarak da çalışabilir.
Yeni kanıtlar, kas kütlesi ve miyofiber bütünlüğünü korumak için otofajinin gerekli olduğunu göstermektedir 19,20 ve Duchenne Musküler Distrofi (DMD) dahil olmak üzere farklı kas distrofileri 21 , 22 , 23'de bozulmuş olduğu bildirilmiştir 24 , 25 , 26 , 27 </suBenzer şekilde, kas kütlesi kaybına (sarkopenik olarak) 32 , 33 , 34 , 35 yaşlarında yaşlılarda otofajik progresifin ilerleyici bir azalması gözlemlenmiştir ( 32 , 33 , 34 , 35 ) , 35 , 36 , 37 ve myofiber sağkalımda 38 .
Otofaji ile iskelet kasının rejeneratif potansiyeli arasındaki yakın ilişki Wagers laboratuarında yapılan bir çalışmada öngörüldü ve kalori kısıtlamasının MuSC'nin kullanılabilirliğini ve aktivitesini arttırdığını gösterdi 39 . Bu hayırFoxo3-Notch ekseni, kendi kendine yenileme 40 sırasında otofajik işlemi aktive etti ve MuSC geçişi durdurma durumundan prolifere hale getirme durumuna geçtiğine dair son gözlem tarafından desteklendi 41 . Bu veriler, genç yaşlı ve geriatrik MuSC'lere bazal otofajinin kademeli olarak azaltılması ve 42 yaşındaki MUHS'lerin sayısal ve fonksiyonel düşüşüyle birlikte kabul edilmektedir.
Yeni bir makalede, otofaji ile DMD progresyonunun erken safhalarını ayıran telafi edici kas rejenerasyonu arasında yakın bir ilişki olduğunu gösterdik. Buna göre, kas yenilenmesinden ödün verildiğinde ve fibrotik doku birikimi oluştuğunda, hastalığın ilerlemesinin ilerleyen aşamalarında azaltılmış otofajik akı bulduk. İlginçtir ki, yenilenen koşullarda otofajinin MuSC'lerde aktive edildiğini ve otofajik süreci modüle etmenin MuSC aktivasyonunu ve fu'yu etkilediğini gösterdikNasyonellik 30 .
Tamamı, bu veriler normal ve patolojik koşullarda ve ömrü boyunca kas yenilenmesi sırasında MuSC'lerde otofajik süreci araştırmanın aciliyetini vurguluyor. Burada, kas yenileme koşullarında MuSC'lerde otofajik işlemi izleyen bir protokol, otofajinin 43'ü olan mikrotübüle bağlı protein 1A / 1B-hafif zincir 3 (LC3) ve MyoD'nin bir markörü olan in situ immün boyama işlemi gerçekleştirerek Miyogenik soy, kontrol ve yaralı farelerin kas dokusu bölümlerinde. Bildirilen metodoloji, kas rejenerasyonunun düzenlenmesinde önemli bir rol oynayan MuSC adlı belirli bir hücre bölmesindeki otofajik sürecin izlenmesine izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol telafi edici kas rejenerasyonu sırasında iskelet kası kök hücrelerinde otofajinin nasıl izleneceğini açıklamaktadır. LC3 ve MyoD'nin birlikte lekelenmesi için çeşitli antikorlar denendi ve fare dokusu kesitlerinde çalışan ve başarılı sonuçlar oluşturan antikorlar burada listelenmiştir (bkz. Malzeme Tablosu ). Başarılı bir boyama için metanol ile permeabilizasyon (bkz. Adım 3.2.2) önerilir.
Bu protokolün sın…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, NIAMS AR064873, Epigen Project PB tarafından desteklendi. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT – LL
Materials
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0,5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt – Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO – Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
Referenzen
- Bentzinger, C. F., et al. Differential response of skeletal muscles to mTORC1 signaling during atrophy and hypertrophy. Skelet Muscle. 3 (1), (2013).
- Chakkalakal, J. V., et al. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
- Jang, Y. C., et al. Skeletal muscle stem cells: effects of aging and metabolism on muscle regenerative function. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 101-111 (2011).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Collins, C. A., Partridge, T. A. Self-renewal of the adult skeletal muscle satellite cell. Cell Cycle. 4 (10), 1338-1341 (2005).
- Bentzinger, C. F., et al. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nat Med. 20 (3), 265-271 (2014).
- Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nat Med. 20 (3), 255-264 (2014).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Madaro, L., Latella, L. Forever young: rejuvenating muscle satellite cells. Front Aging Neurosci. 7, 37 (2015).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Tierney, M. T., et al. STAT3 signaling controls satellite cell expansion and skeletal muscle repair. Nat Med. 20 (10), 1182-1186 (2014).
- Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: collaborators or saboteurs?. FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
- Kroemer, G., Marino, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40 (2), 280-293 (2010).
- Marino, G., Madeo, F., Kroemer, G. Autophagy for tissue homeostasis and neuroprotection. Curr Opin Cell Biol. 23 (2), 198-206 (2011).
- Jiang, P., Mizushima, N. Autophagy and human diseases. Cell Res. 24 (1), 69-79 (2014).
- Eskelinen, E. L. Doctor Jekyll and Mister Hyde: autophagy can promote both cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12, 1468-1472 (2005).
- Basile, V., et al. bis-Dehydroxy-Curcumin triggers mitochondrial-associated cell death in human colon cancer cells through ER-stress induced autophagy. PLoS One. 8 (1), e53664 (2013).
- Neel, B. A., Lin, Y., Pessin, J. E. Skeletal muscle autophagy: a new metabolic regulator. Trends Endocrinol Metab. 24 (12), 635-643 (2013).
- Sandri, M. Autophagy in skeletal muscle. FEBS Lett. 584 (7), 1411-1416 (2010).
- Grumati, P., et al. Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies, and its reactivation rescues myofiber degeneration. Nat Med. 16 (11), 1313-1320 (2010).
- Chrisam, M., et al. Reactivation of autophagy by spermidine ameliorates the myopathic defects of collagen VI-null mice. Autophagy. 11 (12), 2142-2152 (2015).
- Grumati, P., et al. Autophagy induction rescues muscular dystrophy. Autophagy. 7 (4), 426-428 (2011).
- De Palma, C., et al. Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy. Cell Death Dis. 3, e418 (2012).
- Hindi, S. M., et al. Distinct roles of TRAF6 at early and late stages of muscle pathology in the mdx model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (6), 1492-1505 (2014).
- Pauly, M., et al. AMPK activation stimulates autophagy and ameliorates muscular dystrophy in the mdx mouse diaphragm. Am J Pathol. 181 (2), 583-592 (2012).
- Spitali, P., et al. Autophagy is Impaired in the Tibialis Anterior of Dystrophin Null Mice. PLoS Curr. 5, (2013).
- Whitehead, N. P. Enhanced autophagy as a potential mechanism for the improved physiological function by simvastatin in muscular dystrophy. Autophagy. 12 (4), 705-706 (2016).
- Whitehead, N. P., et al. A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (41), 12864-12869 (2015).
- Fiacco, E., et al. Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles. Cell Death Differ. 23 (11), 1839-1849 (2016).
- Lee, I. H., et al. A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3374-3379 (2008).
- Rubinsztein, D. C., Mariño, G., Kroemer, G. Autophagy and aging. Cell. 146 (5), 682-695 (2011).
- Colman, R. J., et al. Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys. Science. 325 (5937), 201-204 (2009).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132 (1), 27-42 (2008).
- Yang, L., et al. Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle. Cell Rep. 14 (3), 422-428 (2016).
- Wenz, T., et al. Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20405-20410 (2009).
- Carnio, S., et al. Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging. Cell Rep. , (2014).
- Sandri, M., et al. Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies. J Cell Sci. 126 (Pt 23), 5325-5333 (2013).
- Cerletti, M., et al. Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function. Cell Stem Cell. 10 (5), 515-519 (2012).
- Gopinath, S. D., et al. FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal. Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).
- Tang, A. H., Rando, T. A. Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation. EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).
- Garcia-Prat, L., et al. Autophagy maintains stemness by preventing senescence. Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
