Coloração imunofluorescente in situ de autofagia em células estaminais musculares
Summary
A autofagia ativa está associada à regeneração muscular produtiva, que é essencial para a ativação da célula tronco (MuSC). Aqui, fornecemos um protocolo para a detecção in situ de LC3, um marcador de autofagia em MuSCs MyoD-positivos de seções de tecido muscular de ratos controlados e feridos.
Abstract
O aumento da evidência aponta para a autofagia como um processo regulatório crucial para preservar a homeostase do tecido. Sabe-se que a autofagia está envolvida no desenvolvimento e regeneração do músculo esquelético, e o processo autofágico foi descrito em várias patologias musculares e distúrbios musculares relacionados à idade. Um bloco recentemente descrito do processo autofágico que se correlaciona com o esgotamento funcional das células satélites durante o reparo muscular reúne a noção de que a autofagia ativa é acoplada à regeneração muscular produtiva. Estes dados revelam o papel crucial da autofagia na ativação das células satélites durante a regeneração muscular em condições normais e patológicas, como distrofias musculares. Aqui, fornecemos um protocolo para monitorar o processo autofágico no compartimento adulto da célula tronco muscular (MuSC) durante as condições regenerativas musculares. Este protocolo descreve a metodologia de instalação para realizar a imunofluorescência in situ de LC3, umaMarcador de utofagy e MyoD, um marcador de linhagem miogênica, em seções de tecido muscular de ratos controlados e feridos. A metodologia relatada permite monitorar o processo autofágico em um compartimento celular específico, o compartimento MuSC, que desempenha um papel central na orquestação da regeneração muscular.
Introduction
A regeneração muscular esquelética é o resultado da interação entre células estaminais adultas (células musculares de músculo, MuSCs) e outros tipos de células envolvidas no processo regenerativo. A homeostase muscular e a funcionalidade são mantidas pelos sinais combinados decorrentes do nicho muscular e das indicações sistêmicas 1 , 2 . Ao longo da vida, foram relatadas mudanças na funcionalidade MuSC, no nicho muscular e nas pistas sistêmicas, levando ao declínio das capacidades funcionais nos idosos 3 . Os MuSCs são definidos em um nicho abaixo da lâmina basal e, após lesão muscular, são ativados para reparar os músculos danificados 4 , 5 . Para garantir uma resposta regenerativa produtiva, é crucial que os MuSCs coordenem os diferentes processos necessários para a saída da quiescência, a auto-renovação e o estágio de expansão proliferativa seguiramPela diferenciação miogênica 6 . Nos idosos e nas doenças crônicas musculares, todas essas funções são comprometidas, levando a funcionalidades musculares alteradas 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .
A macroautofagia (referida a seguir como autofagia) está emergindo como um processo biológico crucial essencial para preservar a homeostase dos tecidos 14 . O processo autofágico inclui mecanismos de tráfico, em que partes de citoplasma, organelas e proteínas são engrossadas em vesículas que eventualmente são degradadas através da via do lisossoma, promovendo a remoção de moléculas tóxicas e a reciclagem de macromoleCules. Isso fornece compostos ricos em energia para apoiar a adaptação das células e tecidos sob estresse ou outras condições adversas 15 , 16 . Juntamente com a sua atividade de sobrevivência celular, a autofagia também pode funcionar como indutor de morte celular, dependendo do contexto do tecido celular ( por exemplo, tecido normal versus câncer) e do tipo de estímulo de estresse 17 , 18 .
Evidências recentes indicam que a autofagia é necessária para manter a massa muscular e a integridade da miofibra 19 , 20 e foi relatada como prejudicada em diferentes distrofias musculares 21 , 22 , 23 , incluindo a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 </suP> , 28 , 29 , 30. Da mesma forma, uma redução progressiva do processo autofágico foi observada nos idosos 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , após perda de massa muscular (referida como sarcopenia) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 e na sobrevivência de miofibra 38 .
Uma relação estreita entre a autofagia e o potencial regenerativo dos músculos esqueléticos foi antecipada por um estudo do laboratório de Wagers, que mostrou que uma restrição calórica aumenta a disponibilidade e a atividade de MuSC 39 . Isso nãoFoi ainda apoiada pela recente observação de que o eixo Foxo3-Notch ativa o processo autofágico durante a auto-renovação 40 e a transição MuSC do estado quiescente para o estado proliferativo 41 . Esses dados concordam com a redução progressiva da autofagia basal de MuSCs jovens e antigos e geriátricos, em associação com o declínio numérico e funcional de MuSCs durante o envelhecimento 42 .
Em um artigo recente, demonstramos uma estreita relação entre a autofagia e a regeneração muscular compensatória que distingue os estágios iniciais da progressão da DMD. Consequentemente, observamos um fluxo autofágico reduzido nos estágios posteriores da progressão da doença, quando a regeneração muscular é comprometida e a deposição de tecido fibrótico ocorre. Intrigantemente, mostramos que, em condições de regeneração, a autofagia é ativada nos MuSCs e que a modulação do processo autofágico afeta a ativação MuSC e o fuNação universal 30 .
No total, esses dados destacam a urgência de explorar o processo autofágico em MuSCs durante a regeneração muscular em condições normais e patológicas e ao longo da vida. Aqui, fornecemos um protocolo para monitorar o processo autofágico em MuSCs nas condições regenerativas musculares, realizando imunocoloração in situ para proteína 1A / 1B-cadeia leve 3 (LC3) associada a microtúbulos, um marcador de autofagia 43 e MyoD, um marcador de Linhagem miogênica, em seções de tecido muscular de ratos controlados e feridos. A metodologia relatada permite monitorar o processo autofágico em um compartimento celular específico, o MuSC, que desempenha um papel fundamental na orquesta da regeneração muscular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve como monitorar a autofagia nas células-tronco do músculo esquelético durante a regeneração muscular compensatória. Vários anticorpos para co-coloração de LC3 e MyoD foram testados, e aqueles que trabalham em seções de tecido de mouse e criam resultados bem-sucedidos estão listados aqui (ver Tabela de Materiais ). A permeabilização com metanol (ver passo 3.2.2) é altamente recomendável para coloração bem sucedida.
A limitação …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo NIAMS AR064873, Epigen Project PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT para LL
Materials
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0,5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt – Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO – Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
Referenzen
- Bentzinger, C. F., et al. Differential response of skeletal muscles to mTORC1 signaling during atrophy and hypertrophy. Skelet Muscle. 3 (1), (2013).
- Chakkalakal, J. V., et al. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
- Jang, Y. C., et al. Skeletal muscle stem cells: effects of aging and metabolism on muscle regenerative function. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 101-111 (2011).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Collins, C. A., Partridge, T. A. Self-renewal of the adult skeletal muscle satellite cell. Cell Cycle. 4 (10), 1338-1341 (2005).
- Bentzinger, C. F., et al. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nat Med. 20 (3), 265-271 (2014).
- Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nat Med. 20 (3), 255-264 (2014).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Madaro, L., Latella, L. Forever young: rejuvenating muscle satellite cells. Front Aging Neurosci. 7, 37 (2015).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Tierney, M. T., et al. STAT3 signaling controls satellite cell expansion and skeletal muscle repair. Nat Med. 20 (10), 1182-1186 (2014).
- Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: collaborators or saboteurs?. FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
- Kroemer, G., Marino, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40 (2), 280-293 (2010).
- Marino, G., Madeo, F., Kroemer, G. Autophagy for tissue homeostasis and neuroprotection. Curr Opin Cell Biol. 23 (2), 198-206 (2011).
- Jiang, P., Mizushima, N. Autophagy and human diseases. Cell Res. 24 (1), 69-79 (2014).
- Eskelinen, E. L. Doctor Jekyll and Mister Hyde: autophagy can promote both cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12, 1468-1472 (2005).
- Basile, V., et al. bis-Dehydroxy-Curcumin triggers mitochondrial-associated cell death in human colon cancer cells through ER-stress induced autophagy. PLoS One. 8 (1), e53664 (2013).
- Neel, B. A., Lin, Y., Pessin, J. E. Skeletal muscle autophagy: a new metabolic regulator. Trends Endocrinol Metab. 24 (12), 635-643 (2013).
- Sandri, M. Autophagy in skeletal muscle. FEBS Lett. 584 (7), 1411-1416 (2010).
- Grumati, P., et al. Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies, and its reactivation rescues myofiber degeneration. Nat Med. 16 (11), 1313-1320 (2010).
- Chrisam, M., et al. Reactivation of autophagy by spermidine ameliorates the myopathic defects of collagen VI-null mice. Autophagy. 11 (12), 2142-2152 (2015).
- Grumati, P., et al. Autophagy induction rescues muscular dystrophy. Autophagy. 7 (4), 426-428 (2011).
- De Palma, C., et al. Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy. Cell Death Dis. 3, e418 (2012).
- Hindi, S. M., et al. Distinct roles of TRAF6 at early and late stages of muscle pathology in the mdx model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (6), 1492-1505 (2014).
- Pauly, M., et al. AMPK activation stimulates autophagy and ameliorates muscular dystrophy in the mdx mouse diaphragm. Am J Pathol. 181 (2), 583-592 (2012).
- Spitali, P., et al. Autophagy is Impaired in the Tibialis Anterior of Dystrophin Null Mice. PLoS Curr. 5, (2013).
- Whitehead, N. P. Enhanced autophagy as a potential mechanism for the improved physiological function by simvastatin in muscular dystrophy. Autophagy. 12 (4), 705-706 (2016).
- Whitehead, N. P., et al. A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (41), 12864-12869 (2015).
- Fiacco, E., et al. Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles. Cell Death Differ. 23 (11), 1839-1849 (2016).
- Lee, I. H., et al. A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3374-3379 (2008).
- Rubinsztein, D. C., Mariño, G., Kroemer, G. Autophagy and aging. Cell. 146 (5), 682-695 (2011).
- Colman, R. J., et al. Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys. Science. 325 (5937), 201-204 (2009).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132 (1), 27-42 (2008).
- Yang, L., et al. Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle. Cell Rep. 14 (3), 422-428 (2016).
- Wenz, T., et al. Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20405-20410 (2009).
- Carnio, S., et al. Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging. Cell Rep. , (2014).
- Sandri, M., et al. Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies. J Cell Sci. 126 (Pt 23), 5325-5333 (2013).
- Cerletti, M., et al. Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function. Cell Stem Cell. 10 (5), 515-519 (2012).
- Gopinath, S. D., et al. FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal. Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).
- Tang, A. H., Rando, T. A. Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation. EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).
- Garcia-Prat, L., et al. Autophagy maintains stemness by preventing senescence. Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
