ב Situ Immunofluorescent מכתים של autophagy בתאי גזע שריר
Summary
Autophagy פעיל קשורה התחדשות שריר פרודוקטיבי, אשר חיוני עבור תא גזע שריר (MuSC) ההפעלה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לזיהוי באתרה של LC3, סמן autophagy ב MyocS חיובי Myocs של קטעים רקמות שריר מן שליטה ועכברים שנפגעו.
Abstract
הגדלת ראיות נקודות autophagy כתהליך חיוני רגולציה כדי לשמור על הומאוסטזיס רקמות. ידוע כי autophagy מעורב בפיתוח שריר השלד התחדשות, ואת תהליך autophagic תוארה בכמה פתולוגיות שרירים והפרעות שרירים הקשורים לגיל. בלוק המתואר לאחרונה של תהליך autophagic כי בקורלציה עם התשישות תפקודית של תאים לווין במהלך תיקון שרירים תומך ברעיון autophagy פעיל הוא בשילוב עם התחדשות שריר פרודוקטיבי. נתונים אלה לחשוף את התפקיד המכריע של autophagy הפעלה תא הלוויין במהלך התחדשות שריר בתנאים נורמליים ופתולוגיים, כגון דיסטרופיות שרירים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול כדי לפקח על תהליך autophagic בתא גזע מבוגר גזע תא גזע (MuSC) במהלך שריר תנאי regenerative. פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה ההתקנה לבצע הדמיה immunofluorescence באתרה של LC3, אסמן אוטופגי, ו- MyoD, סמן השושלת myogenic, בחלקי רקמת השריר של שליטה ועכברים שנפגעו. המתודולוגיה דיווח מאפשר מעקב אחר תהליך autophagic תא תא מסוים אחד, תא MuSC, אשר ממלא תפקיד מרכזי בתזמון שריר תזמור.
Introduction
התחדשות שריר השלד היא תוצאה של האינטראקציה בין תאי גזע בוגרים (תאי שריר תאים, MuSCs) וסוגים אחרים של תאים המעורבים בתהליך הרגנרציה. שריר הומיאוסטזיס ופונקציונליות נשמרים על ידי האותות המשולבים הנובעים נישה שרירים רמזים מערכתית 1 , 2 . לאורך כל תקופת החיים, דווח על שינויים בפונקציונליות ה- MuSC, בנישת השרירים וברמזים המערכתיים, דבר שהוביל לירידה ביכולת התפקוד בקרב קשישים. MuSCs ממוקמים בנישה מתחת הלמידה הבסיסית, על פגיעה בשריר, מופעלים לתקן שרירים פגומים 4 , 5 . כדי להבטיח תגובה משופרת יצרנית, חיוני כי MuSCs לתאם תהליכים שונים הדרושים ליציאה מן השלווה, את ההתחדשות העצמית, ואת שלב ההתפשטות השגשוג ואחריועל ידי בידול myogenic 6 . אצל קשישים ובמחלות כרוניות שריריות, כל הפונקציות האלה נפגעות, מה שמוביל לפונקציונליות שריר שונה 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .
Macroautophagy (המכונה להלן autophagy) מתעוררים כתהליך ביולוגי חיוני חיוני לשמר הומאוסטזיס רקמות 14 . התהליך האוטופאגי כולל בתוכו מנגנוני סחר, שבהם חלקים של ציטופלזמה, אברונים וחלבונים נבלעים לתוך שלפוחית שבסופו של דבר מושפלים דרך מסלול הליזוזום, המקדמים את הסרת המולקולות הרעילות ואת מיחזור המאקרומולהCules. זה מספק תרכובות עשירות באנרגיה כדי לתמוך הסתגלות התא והרקמה תחת מתח או תנאים שליליים אחרים 15 , 16 . יחד עם פעילות ההישרדות של התא, autophagy יכול גם לעבוד כגורם למוות של תאים, בהתאם להקשר רקמות התא ( למשל, נורמלי לעומת רקמת סרטן) ואת סוג של גירוי מתח 17 , 18 .
עדויות עדכניות מצביעות על כך ש- autophagy נדרש לשמור על מסת שריר ועל שלמות מיופייר 19 , 20 ודווח כי נפגעות בניוון שרירים שונים 21 , 22 , 23 , כולל Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 </suלעומת זאת, ירידה מתמשכת של תהליך autophagic נצפתה בקרב קשישים 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , לאחר אובדן מסת שריר (המכונה סרקופניה) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , ובהישרדות.
קשר הדוק בין אוטופאגי לבין הפוטנציאל המשובי של שרירי השלד היה צפוי על ידי מחקר ממעבדה של ואגרס, אשר הראה כי הגבלת קלוריות משפר זמינות MuSC ופעילות 39 . זה לאTion נתמך עוד יותר על ידי התצפית האחרונות כי ציר Foxo3-Notch מפעיל את תהליך autophagic במהלך התחדשות עצמית 40 ו- MuSC המעבר מן שקט אל המדינה מתרבים 41 . נתונים אלה מסכימים עם הפחתה הדרגתית של autophagy בסיסית מ – MSCs צעירים עד גילאים גרפיים, יחד עם הירידה המספרי והתפקודי של MuSCs במהלך ההזדקנות 42 .
במאמר שפורסם לאחרונה, הראינו קשר הדוק בין autophagy לבין התחדשות שרירים מפצה אשר מבדיל את השלבים המוקדמים של התקדמות DMD. לפיכך, ראינו שטף autophagic מופחת בשלבים מאוחרים יותר של התקדמות המחלה, כאשר התחדשות שריר נפגעת בתצהיר רקמות fibrotic מתרחשת. מסקרן, הראינו כי, בתנאים התחדשות, autophagy מופעל ב MuSCs וכי modulating את תהליך autophagic משפיע הפעלת MuSC ו פו30 .
בסך הכל, נתונים אלה מדגישים את הדחיפות לחקור את תהליך autophagic ב MuSCs במהלך התחדשות שריר בתנאים נורמליים ופתולוגיים לאורך כל החיים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול כדי לפקח על תהליך autophagic ב MuSCs בתנאים regenerative שרירים על ידי ביצוע immunostaining באתרו עבור חלבון הקשורים microtubule 1A / 1B-Light שרשרת 3 (LC3), סימן של autophagy 43 , ו MyoD, סימן של השושלת myogenic, ב רקמות שריר סעיפים מ שליטה ועכברים שנפגעו. המתודולוגיה דיווחה מאפשרת מעקב אחר תהליך autophagic בתא תא מסוים אחד, MuSC, אשר ממלא תפקיד מפתח תזמון שריר תזמורתי.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר כיצד לפקח autophagy בתאי גזע שריר השלד במהלך התחדשות שרירים מפצה. מספר נוגדנים עבור שיתוף מכתים של LC3 ו MyoD נשפטו, ואת אלה שעובדים קטעי רקמת העכבר וליצור תוצאות מוצלחות מופיעים כאן (ראה טבלה חומרים ). Permeabilization עם מתנול (ראה שלב 3.2.2) מומלץ מאוד מכת?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIAMS AR064873, Epigen Project PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT ל LL
Materials
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0,5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt – Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO – Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
Referenzen
- Bentzinger, C. F., et al. Differential response of skeletal muscles to mTORC1 signaling during atrophy and hypertrophy. Skelet Muscle. 3 (1), (2013).
- Chakkalakal, J. V., et al. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
- Jang, Y. C., et al. Skeletal muscle stem cells: effects of aging and metabolism on muscle regenerative function. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 101-111 (2011).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Collins, C. A., Partridge, T. A. Self-renewal of the adult skeletal muscle satellite cell. Cell Cycle. 4 (10), 1338-1341 (2005).
- Bentzinger, C. F., et al. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nat Med. 20 (3), 265-271 (2014).
- Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nat Med. 20 (3), 255-264 (2014).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Madaro, L., Latella, L. Forever young: rejuvenating muscle satellite cells. Front Aging Neurosci. 7, 37 (2015).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Tierney, M. T., et al. STAT3 signaling controls satellite cell expansion and skeletal muscle repair. Nat Med. 20 (10), 1182-1186 (2014).
- Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: collaborators or saboteurs?. FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
- Kroemer, G., Marino, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40 (2), 280-293 (2010).
- Marino, G., Madeo, F., Kroemer, G. Autophagy for tissue homeostasis and neuroprotection. Curr Opin Cell Biol. 23 (2), 198-206 (2011).
- Jiang, P., Mizushima, N. Autophagy and human diseases. Cell Res. 24 (1), 69-79 (2014).
- Eskelinen, E. L. Doctor Jekyll and Mister Hyde: autophagy can promote both cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12, 1468-1472 (2005).
- Basile, V., et al. bis-Dehydroxy-Curcumin triggers mitochondrial-associated cell death in human colon cancer cells through ER-stress induced autophagy. PLoS One. 8 (1), e53664 (2013).
- Neel, B. A., Lin, Y., Pessin, J. E. Skeletal muscle autophagy: a new metabolic regulator. Trends Endocrinol Metab. 24 (12), 635-643 (2013).
- Sandri, M. Autophagy in skeletal muscle. FEBS Lett. 584 (7), 1411-1416 (2010).
- Grumati, P., et al. Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies, and its reactivation rescues myofiber degeneration. Nat Med. 16 (11), 1313-1320 (2010).
- Chrisam, M., et al. Reactivation of autophagy by spermidine ameliorates the myopathic defects of collagen VI-null mice. Autophagy. 11 (12), 2142-2152 (2015).
- Grumati, P., et al. Autophagy induction rescues muscular dystrophy. Autophagy. 7 (4), 426-428 (2011).
- De Palma, C., et al. Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy. Cell Death Dis. 3, e418 (2012).
- Hindi, S. M., et al. Distinct roles of TRAF6 at early and late stages of muscle pathology in the mdx model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (6), 1492-1505 (2014).
- Pauly, M., et al. AMPK activation stimulates autophagy and ameliorates muscular dystrophy in the mdx mouse diaphragm. Am J Pathol. 181 (2), 583-592 (2012).
- Spitali, P., et al. Autophagy is Impaired in the Tibialis Anterior of Dystrophin Null Mice. PLoS Curr. 5, (2013).
- Whitehead, N. P. Enhanced autophagy as a potential mechanism for the improved physiological function by simvastatin in muscular dystrophy. Autophagy. 12 (4), 705-706 (2016).
- Whitehead, N. P., et al. A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (41), 12864-12869 (2015).
- Fiacco, E., et al. Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles. Cell Death Differ. 23 (11), 1839-1849 (2016).
- Lee, I. H., et al. A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3374-3379 (2008).
- Rubinsztein, D. C., Mariño, G., Kroemer, G. Autophagy and aging. Cell. 146 (5), 682-695 (2011).
- Colman, R. J., et al. Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys. Science. 325 (5937), 201-204 (2009).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132 (1), 27-42 (2008).
- Yang, L., et al. Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle. Cell Rep. 14 (3), 422-428 (2016).
- Wenz, T., et al. Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20405-20410 (2009).
- Carnio, S., et al. Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging. Cell Rep. , (2014).
- Sandri, M., et al. Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies. J Cell Sci. 126 (Pt 23), 5325-5333 (2013).
- Cerletti, M., et al. Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function. Cell Stem Cell. 10 (5), 515-519 (2012).
- Gopinath, S. D., et al. FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal. Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).
- Tang, A. H., Rando, T. A. Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation. EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).
- Garcia-Prat, L., et al. Autophagy maintains stemness by preventing senescence. Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
