In situ Immunfluoreszenz Färbung der Autophagie in Muskelstammzellen
Summary
Aktive Autophagie ist mit produktiven Muskelregeneration verbunden, die für die Muskelstammzell-Aktivierung (MuSC) essentiell ist. Hier stellen wir ein Protokoll für die in situ- Detektion von LC3, einen Autophagie-Marker in MyoD-positiven MuSCs von Muskelgewebeabschnitten von Kontroll- und verletzten Mäusen zur Verfügung.
Abstract
Zunehmende Beweise weisen auf Autophagie als einen entscheidenden regulatorischen Prozess zur Erhaltung der Gewebshomöostase. Es ist bekannt, dass Autophagie an der Skelettmuskelentwicklung und -regeneration beteiligt ist und der autophagische Prozess in mehreren Muskelpathologien und altersbedingten Muskelstörungen beschrieben wurde. Ein kürzlich beschriebener Block des autophagischen Prozesses, der mit der funktionellen Erschöpfung von Satellitenzellen während der Muskelreparatur korreliert, unterstützt die Vorstellung, dass aktive Autophagie mit einer produktiven Muskelregeneration gekoppelt ist. Diese Daten zeigen die entscheidende Rolle der Autophagie bei der Aktivierung von Satellitenzellen während der Muskelregeneration sowohl bei normalen als auch bei pathologischen Zuständen wie Muskeldystrophien. Hier stellen wir ein Protokoll zur Überwachung des autophagischen Prozesses im erwachsenen Muskelstammzell (MuSC) -Feld während Muskelregenerationsbedingungen zur Verfügung. Dieses Protokoll beschreibt die Setup-Methodik zur Durchführung in situ Immunfluoreszenz-Bildgebung von LC3, aUtophagie-Marker und MyoD, eine myogene Linie Marker, in Muskelgewebe Abschnitte von der Kontrolle und verletzte Mäuse. Die beschriebene Methodik ermöglicht die Überwachung des autophagischen Prozesses in einem bestimmten Zellkompartiment, dem MuSC-Kompartiment, das eine zentrale Rolle bei der orchestrierenden Muskelregeneration spielt.
Introduction
Die Skelettmuskelregeneration ist das Ergebnis der Wechselwirkung zwischen adulten Stammzellen (Muscle Satellite Cells, MuSCs) und anderen Zelltypen, die am regenerativen Prozess beteiligt sind. Die Muskelhomöostase und die Funktionalität werden durch die kombinierten Signale, die sich aus der Muskelnische und den systemischen Cues 1 , 2 ergeben, aufrechterhalten. Im Laufe des Lebens wurden Veränderungen in der MuSC-Funktionalität, der Muskelnische und den systemischen Stichworten berichtet, was zu einem Rückgang der funktionalen Kapazitäten bei älteren Menschen führte. MuSCs werden in eine Nische unterhalb der Basallamina gesetzt und bei Muskelverletzungen aktiviert, um beschädigte Muskeln 4 , 5 zu reparieren. Um eine produktive regenerative Reaktion zu gewährleisten, ist es entscheidend, dass MuSCs verschiedene Prozesse koordinieren, die für den Ausstieg aus der Ruhe, die Selbsterneuerung und die proliferative Expansionsstufe erforderlich sindDurch die myogene Differenzierung 6 . Bei älteren und bei muskulären chronischen Erkrankungen werden alle diese Funktionen kompromittiert, was zu einer veränderten Muskelfunktionalität 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 führt .
Makroautophagie (nachstehend als Autophagie bezeichnet) entsteht als ein entscheidender biologischer Prozess, der für die Erhaltung der Gewebshomöostase unerlässlich ist. Der autophagische Prozess schließt Handlungsmechanismen ein, bei denen Teile von Zytoplasma, Organellen und Proteinen in Vesikel verschlungen werden, die schließlich über den Lysosomweg abgebaut werden, wodurch die Entfernung von toxischen Molekülen und das Recycling von Makromol gefördert wirdCules Dies liefert energiereiche Verbindungen zur Unterstützung der Zell- und Gewebeanpassung unter Stress oder anderen ungünstigen Bedingungen 15 , 16 . Zusammen mit seiner Zell-Überlebensaktivität kann Autophagie auch als Zell-Todes-Induktor arbeiten, je nach Zellgewebe-Kontext ( z. B. normales gegen Krebsgewebe) und der Art des Stressreizes 17 , 18 .
Der jüngste Beweis deutet darauf hin, dass Autophagie erforderlich ist, um die Muskelmasse und die Myofaser-Integrität 19 , 20 aufrechtzuerhalten und wurde in verschiedenen Muskeldystrophien 21 , 22 , 23 , einschließlich Duchenne Muskeldystrophie (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 , beeinträchtigt </suP> , 28 , 29 , 30. Ebenso wurde bei einem älteren 31 , 32 , 33 , 34 , 35 eine fortschreitende Reduktion des autophagischen Prozesses nach einem Verlust der Muskelmasse (bezeichnet als Sarkopenie) 32 , 33 , 34 beobachtet , 35 , 36 , 37 und im Überleben von Myofiber 38 .
Eine enge Beziehung zwischen Autophagie und dem regenerativen Potenzial der Skelettmuskulatur wurde von einer Studie aus dem Labor von Wagers erwartet, die zeigte, dass eine Kalorienrestriktion die Verfügbarkeit und Aktivität von MuSC erhöht. Dieses neinWurde durch die jüngste Beobachtung weiter unterstützt, dass die Foxo3-Notch-Achse den autophagischen Prozess während der Selbsterneuerung 40 und den MuSC-Übergang vom Ruhe- zum Proliferationszustand 41 aktiviert. Diese Daten stimmen mit der fortschreitenden Verringerung der Basalautophagie von jungen zu alten und geriatrischen MuSCs in Verbindung mit dem numerischen und funktionalen Abfall der MuSCs während des Alterns überein 42 .
In einer neueren Arbeit zeigten wir eine enge Beziehung zwischen Autophagie und der kompensatorischen Muskelregeneration, die die frühen Stadien der DMD-Progression unterscheidet. Dementsprechend beobachteten wir einen reduzierten autophagischen Fluss bei späteren Stadien des Krankheitsverlaufs, wenn die Muskelregeneration beeinträchtigt ist und eine fibrotische Gewebeablagerung auftritt. Faszinierend zeigten wir, dass in regenerierenden Zuständen Autophagie in MuSCs aktiviert wird und dass die Modulation des autophagischen Prozesses die MuSC-Aktivierung und fu beeinflusstNktionalität 30
Insgesamt zeigen diese Daten die Dringlichkeit, den autophagischen Prozess in MuSCs während der Muskelregeneration in normalen und pathologischen Zuständen und während der gesamten Lebensdauer zu erforschen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Überwachung des autophagischen Prozesses in MuSCs in Muskelregenerationsbedingungen durch die Durchführung von in situ Immunfärbung für Mikrotubuli-assoziiertes Protein 1A / 1B-leichte Kette 3 (LC3), ein Marker von Autophagie 43 und MyoD, ein Marker von Myogene Abstammung, in Muskelgewebeabschnitten von der Kontrolle und verletzten Mäusen. Die genannte Methodik ermöglicht die Überwachung des autophagischen Prozesses in einem bestimmten Zellkompartiment, dem MuSC, das eine Schlüsselrolle bei der Orchestrierung der Muskelregeneration spielt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt, wie man Autophagie in Skelettmuskel Stammzellen während der kompensatorischen Muskelregeneration zu überwachen. Mehrere Antikörper für die Co-Färbung von LC3 und MyoD wurden ausprobiert, und diejenigen, die in Mausgewebeabschnitten arbeiten und erfolgreiche Ergebnisse erstellen, sind hier aufgelistet (siehe Materialtabelle ). Die Permeabilisierung mit Methanol (siehe Schritt 3.2.2) ist für eine erfolgreiche Färbung sehr zu empfehlen.
<p clas…Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von NIAMS AR064873, Epigen Project PB unterstützt. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT zu LL
Materials
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0,5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt – Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO – Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
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