In Situ Immunofluorescenti colorazione di autofagia nelle cellule staminali muscolari
Summary
L'autofagia attiva è associata alla rigenerazione muscolare produttiva, che è indispensabile per l'attivazione della mucosa muscolare (MuSC). Qui forniamo un protocollo per la rilevazione in situ di LC3, un marker di autofagia in MuOs MyoD positivi delle sezioni del tessuto muscolare da topi di controllo e feriti.
Abstract
L'aumento delle evidenze indica l'autofagia come un processo regolatorio cruciale per preservare l'omeostasi dei tessuti. È noto che l'autofagia è coinvolta nello sviluppo e nella rigenerazione muscolare dello scheletro, e il processo autofagico è stato descritto in molte patologie muscolari e nei disturbi muscolari legati all'età. Un blocco recentemente descritto del processo autofagico che è correlato con l'esaurimento funzionale delle cellule satellitari durante la riparazione muscolare supporta la nozione che l'autofagia attiva è accoppiata con la rigenerazione muscolare produttiva. Questi dati scoprono il ruolo cruciale dell'autofagia nell'attivazione delle cellule satellite durante la rigenerazione muscolare sia nelle condizioni normali che patologiche, come le distrofie muscolari. Qui forniamo un protocollo per monitorare il processo autofagico nel vano adulto di cellule staminali muscolari (MuSC) durante le condizioni di rigenerazione muscolare. Questo protocollo descrive la metodologia di setup per eseguire in situ immunofluorescenza imaging di LC3, un aMarcatore di utopia, e MyoD, un marcatore di linee miogenico, nelle sezioni del tessuto muscolare da topi di controllo e feriti. La metodologia riportata consente di monitorare il processo autofagico in uno specifico compartimento cellulare, il compartimento MuSC, che svolge un ruolo centrale nell'orchestrare la rigenerazione muscolare.
Introduction
La rigenerazione muscolare scheletrica è il risultato dell'interazione tra cellule staminali adulte (Cellule Muscle Satellite, MuSCs) e altri tipi di cellule che sono coinvolti nel processo rigenerativo. L'omeostasi muscolare e la funzionalità vengono mantenuti dai segnali combinati derivanti dalla nicchia muscolare e dai segnali sistemici 1 , 2 . Durante tutta la vita, sono stati segnalati cambiamenti nella funzionalità MuSC, nella nicchia muscolare e nei segnali sistemici, portando al declino delle capacità funzionali negli anziani 3 . Gli MuSC sono posizionati in una nicchia sotto la lamina basale e, dopo lesioni muscolari, vengono attivate per riparare i muscoli danneggiati 4 , 5 . Al fine di garantire una risposta produttiva rigenerativa, è fondamentale che i MuSC coordinino diversi processi necessari per l'uscita dalla quiescenza, l'autoconsapimento e la fase di espansione proliferativaDalla differenziazione myogenica 6 . Negli anziani e nelle malattie croniche muscolari, tutte queste funzioni sono compromesse, portando a alterate funzionalità muscolare 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .
Macroautophagy (qui di seguito chiamata autofagia) sta emergendo come un processo biologico essenziale essenziale per preservare l'omeostasi dei tessuti 14 . Il processo autofagico racchiude meccanismi di traffico, in cui parti di citoplasma, organelli e proteine vengono inglobate in vescicole che alla fine sono degradate attraverso il sentiero lisosomico, promuovendo la rimozione di molecole tossiche e il riciclaggio di macromolomolecole. Ciò fornisce composti ricchi di energia per supportare l'adattamento cellulare e tessuto sotto stress o altre condizioni avverse 15 , 16 . Insieme all'attività di sopravvivenza della cellula, l'autofagia può anche funzionare come induttore di cellule-morte, a seconda del contesto dei tessuti cellulari ( ad es. Normale rispetto al tessuto tumorale) e del tipo di stress 17 , 18 .
Recenti evidenze indicheranno che l'autofagia è necessaria per mantenere la massa muscolare e l'integrità miofibra 19 e 20 ed è stato riportato di essere alterato nelle distrofie muscolari differenti 21 , 22 , 23 , tra cui la distrofia muscolare Duchenne (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 </suInoltre, una riduzione progressiva del processo autofagico è stata osservata negli anziani 31 , 32 , 33 , 34 , 35 dopo una perdita di massa muscolare (chiamata sarcopenia) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , e nella sopravvivenza di myofiber 38 .
Un rapporto stretto tra l'autofagia e il potenziale rigenerativo dei muscoli scheletrici è stato anticipato da uno studio del laboratorio di Wagers, che ha dimostrato che una restrizione calorica aumenta la disponibilità e l'attività 39 di MuSC. Questo noÈ stato ulteriormente sostenuto dalla recente osservazione che l'asse Foxo3-Notch attiva il processo autofagico durante l'autocompensamento 40 e la transizione MuSC dalla quiescenza allo stato proliferante 41 . Questi dati sono d'accordo con la progressiva riduzione dell'autofagia basale da giovani a muSC vecchi e geriatriche, in associazione al declino numerico e funzionale delle mucsi durante l'invecchiamento 42 .
In un recente studio abbiamo dimostrato una stretta relazione tra l'autofagia e la rigenerazione muscolare compensativa che distingue le prime fasi della progressione del DMD. Di conseguenza, abbiamo osservato un flusso autofagico ridotto nelle fasi successive della progressione della malattia, quando si compromette la rigenerazione muscolare e si verifica la deposizione di tessuti fibrotici. Intrigante, abbiamo mostrato che, in condizioni di rigenerazione, l'autofagia è attivata in MuSCs e che la modulazione del processo autofagico impatta l'attivazione di MuSC e fuNicità 30 .
Complessivamente, questi dati evidenziano l'urgenza di esplorare il processo autofagico in MuSC durante la rigenerazione muscolare in condizioni normali e patologiche e per tutta la durata della vita. Qui forniamo un protocollo per monitorare il processo autofagico in MuSCs in condizioni di rigenerazione muscolare eseguendo in immunoterapia in situ la catena leggera 1A / 1B-light 3 (LC3), un marker di autophagy 43 e MyoD, un marker di Lineage miogenico, nelle sezioni del tessuto muscolare da topi di controllo e feriti. La metodologia riportata consente di monitorare il processo autofagico in uno specifico compartimento cellulare, il MuSC, che svolge un ruolo chiave nell'orchestrare la rigenerazione muscolare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive come monitorare l'autofagia nelle cellule staminali muscolari scheletriche durante la rigenerazione muscolare compensatoria. Diversi anticorpi per la co-colorazione di LC3 e MyoD sono stati testati e quelli che lavorano nelle sezioni dei tessuti del mouse e creano risultati efficaci sono elencati qui (vedi tabella dei materiali ). La permeabilizzazione con metanolo (vedere la fase 3.2.2) è altamente raccomandata per una corretta colorazione.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da NIAMS AR064873, Epigen Project PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT a LL
Materials
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0,5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt – Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO – Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
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