Dosage pour la Phosphorylation et microtubules liaison avec localisation de la protéine Tau dans les cellules du Cancer Colorectal
Summary
Ce manuscrit décrit les protocoles normalisés pour mesurer les tau hyperphosphorylée, mesure contraignante de tau de microtubules et la localisation de tau intracellulaire suivant des traitements médicamenteux. Ces protocoles peuvent être utilisés répétitivement pour le dépistage de drogues ou autres composés qui ciblent tau hyperphosphorylée ou microtubules contraignant.
Abstract
La protéine associée aux microtubules tau est une protéine neuronale qui se localise principalement dans les axones. Généralement les tau est essentiel pour le fonctionnement neuronal normal car elle est impliquée dans la stabilisation et l’assemblage des microtubules. En plus de neurones, tau est exprimée en maternel, de la prostate, colorectal, cancer gastrique et des cancers du pancréas où il montre une structure presque similaire et exerce des fonctions semblables comme le tau neuronale. Le montant de tau et sa phosphorylation peut changer sa fonction comme un stabilisateur de microtubules et aboutir à l’élaboration des filaments hélicoïdaux appariés dans les troubles neurodégénératifs différents, tels que la maladie d’Alzheimer. Il est important de déterminer l’état de phosphorylation de tau et ses caractéristiques de liaison de microtubules. En outre, examiner la localisation intracellulaire de tau est important dans différentes maladies. Ce manuscrit détails des protocoles standard pour la mesure de la phosphorylation de tau et liaison tau aux microtubules dans les cellules de cancer colorectal avec ou sans la curcumine et le traitement de LiCl. Ces traitements peuvent être administrés pour arrêter le développement et la prolifération des cellules cancéreuses. Localisation intracellulaire de tau est examinée à l’aide de l’immunohistochimie et la microscopie confocale lors de l’utilisation de faibles quantités d’anticorps. Ces tests peuvent servir répétitivement pour criblage de composés qui affectent les tau hyperphosphorylée ou liaison de microtubules. Nouvelles thérapeutiques utilisées pour différents tauopathies ou agents anticancéreux connexes peuvent potentiellement être caractérisées à l’aide de ces protocoles.
Introduction
Tau a été initialement identifiée comme étant une protéine associée aux microtubules thermostable qui a été purifiée conjointement avec la tubuline1. Tau est exprimée exclusivement en plus eucaryotes2,3,4. La fonction principale de tau est de contrôler les microtubules Assemblée1,5,6. Elle contribue également à la polymérisation des microtubules7, transport axonal8, changements de diamètre axonal9, formation de polarité neurinome et neurodégénérescence10. Tau agit également comme un échafaudage de protéine pour contrôler certaines voies de signalisation. Études de cerveau chez les rats suggèrent que tau est neurone-spécifique et qu’elle se localise principalement dans les axones11. Parce que la protéine tau est essentiel pour la polymérisation des microtubules et développement neuronal, dans le cas du tau, l’hypothèse a été pour jouer un rôle majeur dans le développement axonal dans le système nerveux central ; Cette hypothèse a été vérifiée par des expériences in vitro et in vivo . En plus des neurones, tau est exprimé dans des cellules non neuronales différentes, y compris le foie, les reins et les cellules de muscle12,13. Tau est exprimée également en maternel, prostate, colorectal, gastrique et le cancer du pancréas cell lines et tissus14,15,16,17,18, 19. tau est également trouvée dans myositis de corps d’inclusion comme tubulofilaments tordu dans le corps d’inclusion20.
Tau peut effectuer plusieurs modifications post-traductionnelles. Toutes les modifications post-traductionnelles, la phosphorylation est la plus courante. La phosphorylation de tau accrue diminue son affinité pour les microtubules, enfin déstabiliser le cytosquelette. Quatre-vingt cinq sites de phosphorylation ont été décrits dans la protéine tau isolé des tissus cérébraux humains la maladie d’Alzheimer. De ces sites, 53 % constituent des sérine, thréonine de 41 % et 6 % seulement des22,de21,de résidus tyrosine23. La phosphorylation de Tau influe sur sa localisation, fonction, liaison, solubilité et sa sensibilité aux autres modifications post-traductionnelles. Aussi tau phosphorylation dépasse la mesure normale (ou complètement saturée avec des groupes de phosphate) est connu comme hyperphosphorylée qui reproduit les caractéristiques structurales et fonctionnelles de la maladie d’Alzheimer24. Tau maintient le bon fonctionnement des microtubules axonales et assure un fonctionnement neuronal normal dans des conditions physiologiques. Toutefois, le tau hyperphosphorylée ne parvient pas à maintenir une liaison de microtubules bien organisé, causant la perte neuronale en raison du démontage de microtubules. Des niveaux normaux de la phosphorylation de tau sont requises pour tau de bon fonctionnement, mais tau ne parvient pas à fonctionner normalement si son niveau de phosphorylation caractéristique est modifiée et si elle est hyperphosphorylée25. Dans la maladie d’Alzheimer et de certaines autres maladies neurodégénératives liées à l’âge, tau devient hyperphosphorylée et forme des filaments hélicoïdaux appariés et les enchevêtrements neurofibrillaires26,27. Ainsi, les méthodes de détermination de la phosphorylation de tau et liaison de microtubules sont importants.
Le cancer colorectal, un cancer lié au vieillissement, est que le troisième plus fréquemment diagnostiquée cancer et le troisième important causant des décès pour les hommes et les femmes28. Le cancer colorectal est un des principaux cancers causant des décès dans le monde occidental29. Parce que le cancer colorectal et la maladie d’Alzheimer sont associés au vieillissement et les deux se produisent principalement dans les pays développés où les gens apprécient des habitudes alimentaires similaires, les deux maladies peuvent en quelque sorte être corrélés. En outre, les cellules cancéreuses tau-positifs et négatifs tau réagissent différemment aux agents chimiothérapeutiques, par exemple, paclitaxel16.
La curcumine est l’un des principaux dérivés de Curcuma longa, l’épice indienne curcuma30. Pendant des siècles, les populations sud-asiatiques ont consommé curcuma dans leur alimentation au quotidien. La curcumine est utilisée pour traiter différentes maladies, cancer colorectal, maladie d’Alzheimer, diabète, mucoviscidose, maladie inflammatoire de l’intestin, l’arthrite, hyperlipidémie, athérosclérose, et cardiopathie ischémique31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. lithium peut aussi tuer des cellules de cancer colorectal ou d’empêcher leur prolifération39. Au lithium peut également être utilisé pour le traitement de la maladie d’Alzheimer40 car il diminue l’agrégation tau et empêche sa hyperphosphorylée tel qu’observé dans une souris transgénique modèle41,42,43, 44.
Ce manuscrit a pour but de : 1) mesurer la tau totale et les niveaux d’expression de phospho-tau dans les cellules traitées ; 2) décrivent un dosage de la phosphatase pour mesurer la phosphorylation de tau globale ; 3) examiner microtubule-liaison du tau ; et 4) localiser tau en microscopie confocale en lignées cellulaires de cancer colorectal traités avec la curcumine ou de LiCl. Résultats révèlent que traitement des cellules avec la curcumine, qui est un agent chimiothérapeutique censé être bon pour le cancer du côlon, et le traitement avec LiCl peut réduire l’expression de ces deux tau totale et phosphorylée tau dans les lignées cellulaires de cancer colorectal. Ces traitements peuvent aussi causer la translocation nucléaire du tau. Cependant, contre toute attente, curcumine ne parvient pas à améliorer la liaison des tau aux microtubules.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce manuscrit mis en place des conditions procédurales différentes pour détecter les tau totale et phosphorylé tau dans les cellules de cancer colorectal traités avec la curcumine et de LiCl. Pour évaluer l’état global de la phosphorylation de tau dans les échantillons de protéines, un test de la phosphatase a été décrite. Ce dosage est potentiellement utilisable pour examiner l’état de phosphorylation d’une protéine.
Cette analyse est basée sur le principe selon lequel pho…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été réalisée dans le cadre du projet intitulé « Développement et industrialisation de matières premières cosmétiques de haute valeur de micro-algues marines », financé par le ministère des Océans et la pêche, la Corée et a été financée par une subvention intra-muros (2Z04930) de KIST Gangneung Institut des produits naturels.
Materials
| HCT 116 cell | ATCC | CCL-247 | |
| MEM (EBSS) | Hyclone | SH30024.01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher (Gibco) | 16000044 | Store at -20 °C |
| penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA solution | WelGene | LS 015-01 | |
| 100 mm dish | Corning | 430161 | |
| 6 well plate | Corning | Coster 3516 | |
| Anti-Tau 13 antibody | abcam | ab19030 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Roche | 10 708 984 001 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microlitre Centrifuges | Hettich Zentrifugen | MIKRO 200 R | |
| Paclitaxel | Sigma-Aldrich | T1912 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Curcumin | Sigma-Aldrich (Fluka) | 78246 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microtubules (MT) | Cytoskeleton | MT001 | Store at 4 °C (desiccated) |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Store at 4 °C in the dark |
| Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Store at -20 °C |
| DPBS | WelGene | LB 001-02 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP | |
| PIPES | Sigma | P1851 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Molecular Imager | Bio-Rad | ChemiDoc XRS+ | Store at 4 °C |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
| α-tubulin (11H10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2125 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2118 | |
| Anti-Tau (phospho S396) antibody | abcam | ab109390 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | Store at room temperature |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | Store at -20 °C |
| PMSF | Sigma | P7626 | Store at room temperature |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5870 | Store at 4 °C |
| Protease Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5871 | Store at 4 °C |
| RIPA Buffer | Sigma | R 0278 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Tau-352 human | Sigma | T 9950 | Store at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X – 100 | Store at around 25 °C |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | |
| Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11005 | Store at 4 °C in the dark |
| Confocal Microscopy | Leica Microsystem | Leica TCS SP5 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 75819 | |
| Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Store at 4 °C |
Referenzen
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