Ensayo para la fosforilación y Microtubule obligatorios junto con la localización de la proteína Tau en células de cáncer colorrectal
Summary
Este manuscrito describe protocolos estándar para la medición de la hiperfosforilación de tau, medición de enlace de tau a los microtúbulos y la localización de tau intracelular después de tratamientos con fármacos. Estos protocolos pueden utilizarse repetidamente para la detección de drogas u otros compuestos que enlace la hiperfosforilación o microtúbulos tau.
Abstract
La proteína asociada a microtúbulos tau es una proteína neuronal que se localiza sobre todo en los axones. Generalmente tau es esencial para el funcionamiento neuronal normal porque está implicada en la estabilización y el montaje del microtubule. Además de las neuronas, tau se expresa en mama, próstata, gástrica, colorrectal y los cánceres de páncreas donde se muestra la estructura casi similar y ejerce funciones similares como el tau neuronal. La cantidad de tau y su fosforilación puede cambiar su función como estabilizador de microtúbulos y conducir al desarrollo de filamentos helicoidales apareados en trastornos neurodegenerativos diferentes, como la enfermedad de Alzheimer. Es importante determinar el estado de fosforilación de tau y sus características de unión a microtúbulos. Además, examinar la localización intracelular de tau es importante en diferentes enfermedades. Este manuscrito detalles protocolos estándar para la medición de la fosforilación de tau y de la Unión de tau a los microtúbulos en las células de cáncer colorrectal con o sin tratamiento de LiCl y curcumina. Estos tratamientos pueden utilizarse para detener el desarrollo y proliferación de células de cáncer. Localización intracelular del tau se examina mediante el uso de inmunohistoquímica y microscopía confocal durante el uso de bajas cantidades de anticuerpos. Estos ensayos pueden usarse repetidamente para la detección de compuestos que afectan la hiperfosforilación de tau o atascamiento de microtúbulos. Terapéutica de la novela utiliza para diferentes Tauopatías o relacionados con agentes anticancerígenos potencialmente pueden ser caracterizados mediante estos protocolos.
Introduction
Tau fue identificado originalmente como una proteína asociada a microtúbulos estables al calor que fue co purificada con tubulina1. Tau se expresa exclusivamente en eucariotas superiores2,de3,4. La función principal del tau es controlar microtúbulos Asamblea1,5,6. También contribuye a la polimerización de microtúbulos7, transporte axonal8, cambios en el diámetro axonal9, formación de polaridad de neuroma y neurodegeneración10. Tau también actúa como un andamio de proteínas para el control de algunas vías de señalización. Estudios de cerebro de rata sugieren que tau es específica de la neurona y que principalmente se localiza en axones11. Porque es esencial para el desarrollo neuronal y polimerización de microtúbulos tau, tau fue presumido para desempeñar un papel importante en el desarrollo axonal en el sistema nervioso central; Esta hipótesis fue posteriormente verificado por experimentos in vitro e in vivo . Además de las neuronas, tau se expresa en diversas células no neuronales, incluyendo hígado, riñón y músculo células12,13. Tau se expresa también en mama, próstata, colorrectal, gástrica y cáncer pancreático células líneas y tejidos14,15,16,17,18, 19. tau también se encuentra en myositis del cuerpo de inclusión como trenzado tubulofilaments en cuerpos de inclusión20.
Tau puede llevar varias modificaciones poste-de translación. De todas las modificaciones post-traduccionales, fosforilación es la más común. Fosforilación de tau mayor disminuye su afinidad por los microtúbulos, finalmente desestabilizar el citoesqueleto. Se han descrito sitios de fosforilación de ochenta y cinco en aislados de los tejidos del cerebro humano la enfermedad de Alzheimer la proteína tau. De estos sitios, 53% son serina, treonina 41% y sólo 6% tirosina residuos21,22,23. Fosforilación de Tau afecta a su localización, función, enlace, solubilidad y su susceptibilidad a otras modificaciones poste-de translación. También la fosforilación de tau a más de lo normal (o completamente saturado con grupos fosfato) se conoce como la hiperfosforilación que imita las características estructurales y funcionales de la enfermedad de Alzheimer24. Mantiene el buen funcionamiento de los microtúbulos axonales y asegura el funcionamiento neuronal normal bajo condiciones fisiológicas. Sin embargo, tau hiperfosforilada es incapaz de mantener un enlace de microtúbulos bien organizado, causando la pérdida neuronal por desmontaje de microtúbulos. Niveles normales de la fosforilación de tau se requieren para tau correcto funcionamiento, pero tau no funciona normalmente si se altera su nivel de fosforilación característico y si está hiperfosforilada25. En la enfermedad de Alzheimer y algunos otros trastornos neurodegenerativos relacionados con la edad, se convierte en hiperfosforilada y forma los filamentos helicoidales apareados y los enredos de neurofibrillary26,27. Por lo tanto, métodos para la determinación de la fosforilación de tau y Unión de los microtúbulos son importantes.
Cáncer colorrectal, un cáncer asociado a envejecimiento, es que la tercera más frecuentemente diagnosticado cáncer y el tercer prominente que causan la muerte para hombres y mujeres28. El cáncer colorrectal es uno de los principales cánceres causantes de muerte en el mundo occidental29. Porque el cáncer colorrectal y la enfermedad de Alzheimer están asociados con el envejecimiento y ambos suceden principalmente en los países desarrollados donde disfrutar de los hábitos alimentarios similares, las dos enfermedades de alguna manera pueden correlacionarse. Además, las células cancerosas tau-positivas y negativas de tau responden de diferente manera a los agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, paclitaxel16.
La curcumina es uno de los principales derivados de la longa de la cúrcuma, la especia India cúrcuma30. Durante siglos, las poblaciones del sur de Asia han consumido cúrcuma en su dieta diariamente. La curcumina se usa para tratar diferentes enfermedades, incluyendo cáncer colorrectal, la enfermedad de Alzheimer, diabetes, fibrosis quística, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis, hiperlipidemia, aterosclerosis y cardiopatía isquémica31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. litio también puede matar a las células de cáncer colorrectal o prevenir su proliferación39. Litio puede usarse para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer40 ya que disminuye la agregación de tau y previene su hiperfosforilación como se observa en un ratón transgénico modelo41,42,43, 44.
Este manuscrito tiene como objetivo: 1) medir la tau total y niveles de expresión de fosfo-tau en células tratadas; 2) describe un ensayo de fosfatasa para medir la fosforilación de tau total; 3) examinar microtubule-obligatorios de tau; y 4) localizar tau mediante microscopía confocal en líneas celulares de cáncer colorrectal tratados con curcumina o LiCl. Los resultados revelan que célula el tratamiento con curcumina, que es un agente quimioterapéutico supuestamente bueno para el cáncer de colon, y tratamiento con LiCl puede reducir la expresión de ambos tau total y fosforila tau en líneas celulares de cáncer colorrectal. Estos tratamientos también pueden causar desplazamiento nuclear de tau. Sin embargo, inesperadamente, la curcumina no mejorar la Unión de tau a los microtúbulos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este manuscrito establece diferentes condiciones procedimentales para la detección de tau total y fosforila tau en células de cáncer colorrectal tratados con curcumina y LiCl. Para evaluar el estado global de la fosforilación de tau en las muestras de proteína, un ensayo de fosfatasa fue descrito. Este ensayo se puede potencialmente utilizar para examinar el estado de fosforilación de alguna proteína.
Este ensayo se basa en el principio de que fosforila la proteína se mueve más lento …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue realizada como parte del proyecto titulado ‘Desarrollo y la industrialización de materia prima cosméticos de microalgas marinas de alto valor’, financiado por el Ministerio de océanos y pesquerías, Corea y fue apoyado por una subvención de intramuros (2Z04930) KIST Gangneung Instituto de productos naturales.
Materials
| HCT 116 cell | ATCC | CCL-247 | |
| MEM (EBSS) | Hyclone | SH30024.01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher (Gibco) | 16000044 | Store at -20 °C |
| penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA solution | WelGene | LS 015-01 | |
| 100 mm dish | Corning | 430161 | |
| 6 well plate | Corning | Coster 3516 | |
| Anti-Tau 13 antibody | abcam | ab19030 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Roche | 10 708 984 001 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microlitre Centrifuges | Hettich Zentrifugen | MIKRO 200 R | |
| Paclitaxel | Sigma-Aldrich | T1912 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Curcumin | Sigma-Aldrich (Fluka) | 78246 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microtubules (MT) | Cytoskeleton | MT001 | Store at 4 °C (desiccated) |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Store at 4 °C in the dark |
| Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Store at -20 °C |
| DPBS | WelGene | LB 001-02 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP | |
| PIPES | Sigma | P1851 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Molecular Imager | Bio-Rad | ChemiDoc XRS+ | Store at 4 °C |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
| α-tubulin (11H10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2125 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2118 | |
| Anti-Tau (phospho S396) antibody | abcam | ab109390 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | Store at room temperature |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | Store at -20 °C |
| PMSF | Sigma | P7626 | Store at room temperature |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5870 | Store at 4 °C |
| Protease Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5871 | Store at 4 °C |
| RIPA Buffer | Sigma | R 0278 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Tau-352 human | Sigma | T 9950 | Store at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X – 100 | Store at around 25 °C |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | |
| Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11005 | Store at 4 °C in the dark |
| Confocal Microscopy | Leica Microsystem | Leica TCS SP5 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 75819 | |
| Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Store at 4 °C |
Referenzen
- Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1858-1862 (1975).
- Cambiazo, V., Gonzalez, M., Maccioni, R. B. DMAP-85: a tau-like protein from Drosophila melanogaster larvae. J Neurochem. 64, 1288-1297 (1995).
- Goedert, M., et al. PTL-1, a microtubule-associated protein with tau-like repeats from the nematode Caenorhabditis elegans. J Cell Sci. 109 (Pt 11), 2661-2672 (1996).
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Jakes, R., Rutherford, D., Crowther, R. A. Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer’s disease. Neuron. 3, 519-526 (1989).
- Cleveland, D. W., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. Purification of tau, a microtubule-associated protein that induces assembly of microtubules from purified tubulin. J Mol Biol. 116, 207-225 (1977).
- Fellous, A., Francon, J., Lennon, A. M., Nunez, J. Microtubule assembly in vitro. Purification of assembly-promoting factors. Eur J Biochem. 78, 167-174 (1977).
- Witman, G. B., Cleveland, D. W., Weingarten, M. D., Kirschner, M. W. Tubulin requires tau for growth onto microtubule initiating sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 73, 4070-4074 (1976).
- Dixit, R., Ross, J. L., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau. Science. 319, 1086-1089 (2008).
- Harada, A., et al. Altered microtubule organization in small-calibre axons of mice lacking tau protein. Nature. 369, 488-491 (1994).
- Caceres, A., Kosik, K. S. Inhibition of neurite polarity by tau antisense oligonucleotides in primary cerebellar neurons. Nature. 343, 461-463 (1990).
- Binder, L. I., Frankfurter, A., Rebhun, L. I. The distribution of tau in the mammalian central nervous system. J Cell Biol. 101, 1371-1378 (1985).
- Gu, Y. J., Oyama, F., Ihara, Y. tau is widely expressed in rat tissues. J Neurochem. 67, 1235-1244 (1996).
- Kenner, L., et al. Expression of three- and four-repeat tau isoforms in mouse liver. Hepatology. 20, 1086-1089 (1994).
- Souter, S., Lee, G. Microtubule-associated protein tau in human prostate cancer cells: isoforms, phosphorylation, and interactions. J Cell Biochem. 108, 555-564 (2009).
- Sangrajrang, S., et al. Estramustine resistance correlates with tau over-expression in human prostatic carcinoma cells. Int J Cancer. 77, 626-631 (1998).
- Rouzier, R., et al. Microtubule-associated protein tau: a marker of paclitaxel sensitivity in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8315-8320 (2005).
- Mimori, K., et al. Reduced tau expression in gastric cancer can identify candidates for successful paclitaxel treatment. Brit J Cancer. 94, 1894-1897 (2006).
- Jimeno, A., et al. Development of two novel benzoylphenylurea sulfur analogues and evidence that the microtubule-associated protein tau is predictive of their activity in pancreatic cancer. Mol Cancer Ther. 6, 1509-1516 (2007).
- Huda, M. N., Kim, D. H., Erdene-Ochir, E., Kim, Y. S., Pan, C. H. Expression, phosphorylation, localization, and microtubule binding of tau in colorectal cell lines. Appl Biol Chem. 59, 807-812 (2016).
- Askanas, V., Engel, W. K., Bilak, M., Alvarez, R. B., Selkoe, D. J. Twisted tubulofilaments of inclusion body myositis muscle resemble paired helical filaments of Alzheimer brain and contain hyperphosphorylated tau. The American journal of pathology. 144, 177-187 (1994).
- Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33, 95-130 (2000).
- Hanger, D. P., Anderton, B. H., Noble, W. Tau phosphorylation: the therapeutic challenge for neurodegenerative disease. Trends Mol Med. 15, 112-119 (2009).
- Sergeant, N., et al. Biochemistry of Tau in Alzheimer’s disease and related neurological disorders. Expert Rev Proteomics. 5, 207-224 (2008).
- Fath, T., Eidenmuller, J., Brandt, R. Tau-mediated cytotoxicity in a pseudohyperphosphorylation model of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 22, 9733-9741 (2002).
- Kolarova, M., Garcia-Sierra, F., Bartos, A., Ricny, J., Ripova, D. Structure and pathology of tau protein in Alzheimer disease. Int J Alzheimers Dis. 2012, 731526 (2012).
- Kosik, K. S., Joachim, C. L., Selkoe, D. J. Microtubule-associated protein tau (tau) is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4044-4048 (1986).
- Wood, J. G., Mirra, S. S., Pollock, N. J., Binder, L. I. Neurofibrillary tangles of Alzheimer disease share antigenic determinants with the axonal microtubule-associated protein tau (tau). Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4040-4043 (1986).
- Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2003. CA Cancer J Clin. 53, 5-26 (2003).
- Patel, V. B., Misra, S., Patel, B. B., Majumdar, A. P. Colorectal cancer: chemopreventive role of curcumin and resveratrol. Nutr Cancer. 62, 958-967 (2010).
- Lim, G. P., et al. The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse. J Neurosci. 21, 8370-8377 (2001).
- Venkatesan, N. Curcumin attenuation of acute adriamycin myocardial toxicity in rats. Br J Pharmacol. 124, 425-427 (1998).
- Srinivasan, M. Effect of curcumin on blood sugar as seen in a diabetic subject. Indian J Med Sci. 26, 269-270 (1972).
- Deodhar, S. D., Sethi, R., Srimal, R. C. Preliminary study on antirheumatic activity of curcumin (diferuloyl methane). Indian J Med Res. 71, 632-634 (1980).
- Rao, C. V., Rivenson, A., Simi, B., Reddy, B. S. Chemoprevention of colon carcinogenesis by dietary curcumin, a naturally occurring plant phenolic compound. Cancer Res. 55, 259-266 (1995).
- Araujo, C. C., Leon, L. L. Biological activities of Curcuma longa L. Mem Inst Oswaldo Cruz. 96, 723-728 (2001).
- Lim, T. G., et al. Curcumin suppresses proliferation of colon cancer cells by targeting CDK2. Cancer Prev Res (Phila). 7, 466-474 (2014).
- Ringman, J. M., Frautschy, S. A., Cole, G. M., Masterman, D. L., Cummings, J. L. A potential role of the curry spice curcumin in Alzheimer’s disease. Curr Alzheimer Res. 2, 131-136 (2005).
- Li, H., et al. Lithium chloride suppresses colorectal cancer cell survival and proliferation through ROS/GSK-3beta/NF-kappaB signaling pathway. Oxid Med Cell Longev. , 241864 (2014).
- Forlenza, O. V., De-Paula, V. J., Diniz, B. S. Neuroprotective effects of lithium: implications for the treatment of Alzheimer’s disease and related neurodegenerative disorders. ACS Chem Neurosci. 5, 443-450 (2014).
- Noble, W., et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by lithium correlates with reduced tauopathy and degeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6990-6995 (2005).
- Perez, M., Hernandez, F., Lim, F., Diaz-Nido, J., Avila, J. Chronic lithium treatment decreases mutant tau protein aggregation in a transgenic mouse model. J Alzheimers Dis. 5, 301-308 (2003).
- Engel, T., Goni-Oliver, P., Lucas, J. J., Avila, J., Hernandez, F. Chronic lithium administration to FTDP-17 tau and GSK-3beta overexpressing mice prevents tau hyperphosphorylation and neurofibrillary tangle formation, but pre-formed neurofibrillary tangles do not revert. J Neurochem. 99, 1445-1455 (2006).
- Caccamo, A., Oddo, S., Tran, L. X., LaFerla, F. M. Lithium reduces tau phosphorylation but not A beta or working memory deficits in a transgenic model with both plaques and tangles. Am J Pathol. 170, 1669-1675 (2007).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Gupta, K. K., Bharne, S. S., Rathinasamy, K., Naik, N. R., Panda, D. Dietary antioxidant curcumin inhibits microtubule assembly through tubulin binding. FEBS J. 273, 5320-5332 (2006).
- Lee, J. W., Park, S., Kim, S. Y., Um, S. H., Moon, E. Y. Curcumin hampers the antitumor effect of vinblastine via the inhibition of microtubule dynamics and mitochondrial membrane potential in HeLa cervical cancer cells. Phytomedicine. 23, 705-713 (2016).
- Liu, F., et al. Site-specific effects of tau phosphorylation on its microtubule assembly activity and self-aggregation. Eur J Neurosci. 26, 3429-3436 (2007).
- Sultan, A., et al. Nuclear tau, a key player in neuronal DNA protection. J Biol Chem. 286, 4566-4575 (2011).
- Bukar Maina, M., Al-Hilaly, Y. K., Serpell, L. C. Nuclear Tau and Its Potential Role in Alzheimer’s Disease. Biomolecules. 6, 9 (2016).
- Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9, 790-803 (2010).
