인 산화 및 대 장 암 세포에 타우 단백질의 지역화 함께 Microtubule 바인딩 분석 결과
Summary
이 원고는 타우 hyperphosphorylation, 타우에 바인딩 microtubules, 및 약물 치료에 따라 세포내의 지역화를 측정을 측정 하기 위한 표준 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 약물 또는 다른 화합물 타우 hyperphosphorylation 또는 microtubule 바인딩 대상 심사에 대 한 반복적으로 사용할 수 있습니다.
Abstract
Microtubule 관련 단백질 타우 주로 축 삭에서 localizes 신경 단백질 이다. 일반적으로 타우 그것은 microtubule 어셈블리 및 안정화에 관여 하기 때문에 정상적인 신경 기능을 위해 필수적 이다.입니다. 뉴런, 게다가 타우 인간 유 방, 전립선, 위, 대 장, 췌 장의 암 거의 비슷한 구조를 보여줍니다 하 고 신경 타우로 유사한 기능을 발휘 하는 있는으로 표현 된다. 타우와의 인 산화의 금액 microtubules, 안정제로 서의 기능을 변경 하 고 다른 신경 퇴행 성 질환, 알 츠 하이 머 병 등에서 쌍을 이루는 나선형 필 라 멘 트의 발전으로 이어질 수 있습니다. 타우와 microtubule 바인딩 특성의 인 산화 상태를 결정 하는 것이 중요 합니다. 또한, 검사의 세포내 지역화 다른 질병에서 중요 하다. 이 원고 내용 표준 프로토콜 타우 인 산화 및 대 장 암 세포 또는 curcumin와 LiCl 치료 없이 microtubules 타우 바인딩을 측정. 이러한 치료는 암 세포 증식 및 개발을 중지 사용할 수 있습니다. 세포내 지역화의 낮은 양의 항 체를 사용 하는 동안 immunohistochemistry 그리고 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 검사 합니다. 이 분석 실험 화합물 타우 hyperphosphorylation 또는 microtubule 바인딩에 영향을 주는 심사에 대 한 반복적으로 사용할 수 있습니다. 다른 tauopathies에 대 한 새로운 치료제 사용 또는 관련된 항 암 에이전트 나타낼 수 있다 잠재적으로 이러한 프로토콜을 사용 하 여.
Introduction
타우 원래 공동 tubulin1순화 했다 열 안정 microtubule 관련 단백질으로 확인 되었다. 타우는 높은 진핵생물2,,34에 독점적으로 표현 된다. 주요 기능 microtubule 어셈블리1,,56을 제어 하는 것입니다. 그것은 또한 합 microtubules7, axonal 전송8, axonal 직경9에 변화, 싱 경종 극성과 neurodegeneration10의 형성에 기여 한다. 타우는 또한 일부 신호 경로 제어 하는 단백질 비 계 역할을 합니다. 쥐 뇌 연구 제안 그 타우는 신경 및 그것은 주로 축 삭11에서 localizes. 타우 중앙 신경; axonal 개발에 중요 한 역할을 가상 했다 타우 microtubule 중 합 및 신경 발달에 필수적 이므로, 이 가설이 나중에 이었다 생체 외에서 그리고 vivo에서 실험에 의해 확인. 신경, 외에도 타우 다른 비 신경 세포, 간, 신장 및 근육 세포12,13를 포함 하 여 표현 됩니다. 타우는 표현 또한 인간의 유 방, 전립선, 대 장, 위, 및 췌장암 세포 라인 조직14,15,16,17,18, 19. 타우 또한 포함 시체20꼬인된 tubulofilaments로 포함-몸 근육에서 발견.
타우는 몇 가지 포스트 번역 상 수정을 있습니다. 모든 포스트 번역 상 수정의 인 산화는 가장 일반적입니다. 증가 타우 인 산화 microtubules, 마지막으로 골격을 불안정에 대 한 선호도 감소 합니다. 85 인 산화 사이트 타우 단백질 Alzheimer의 질병이 인간의 뇌 조직에서 분리에 설명 했습니다. 이 사이트의 53% 구성 떠들고, 41% 트레오닌, 유일한 6% 티로신 잔류물21,,2223입니다. 타우 인 산화의 현지화, 기능, 바인딩, 가용성, 및 다른 포스트 번역 상 수정에의 민감성에 영향을 줍니다. 정상 범위 보다도 타우 인 산화 (또는 인산 염 그룹으로 채도가) 알 츠 하이 머 병24의 구조 및 기능적인 특성을 복제 하는 hyperphosphorylation로 알려져 있다. 타우 axonal microtubules의 적절 한 작동 하 고 생리 적 조건 하에서 정상적인 신경 기능을 보장 합니다. 그러나, hyperphosphorylated 타우 microtubule 해체 때문에 신경 손실의 원인이 조직적된 microtubule 바인딩을 유지 하기 위해 실패 합니다. 타우 인 산화의 정상 수준 기능, 적절 한 타우 필요 하지만 타우의 특성 인 산화 수준을 변경 하는 경우 및 경우 hyperphosphorylated25정상적으로 작동 하는 데 실패. Alzheimer의 질병 그리고 다른 나이 관련 된 신경 장애, 타우 hyperphosphorylated 되 고 형성 하는 대응된 나선형 필 라 멘 트 및 neurofibrillary tangles26,27. 따라서, 타우 인 산화 및 microtubule 바인딩 결정 하는 방법 중요 하다.
대 장 암, 암, 노화 관련 된 세 번째는 가장 자주 암과 세 번째 눈에 띄는 죽음을 일으키는 남성, 여성 모두28암 진단 이다. 대 장 암 서방 세계29주요 사망 원인 암 중 하나입니다. 대 장 암과 Alzheimer의 질병 노화와 관련 된 둘 다 사람들이 비슷한 식습관을 즐길 있는 선진국에서 주로 발생 하기 때문에, 두 질병 어떻게든 상관 될 수 있습니다. 또한, 타우 양수와 음수가 타우 암 세포는 화학요법 대리인, 예를 들면, paclitaxel16에 다르게 응답.
Curcumin은 longa 되더라도, 인도 향미료 심 황30의 주요 파생 상품 중 하나입니다. 수세기 동안, 남쪽 아시아 인구는 매일 그들의 규정식에 있는 심 황을 소모 하 고. Curcumin는 대 장 암, Alzheimer의 질병, 당뇨병, 낭 성 섬유 증, 염증 성 장 질환, 관절염, 혈, 동맥 경화 증 및 허 혈 성 심장 질환31, 등 다른 질병을 치료 하는 데 사용 됩니다. 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. 리튬 또한 대 장 암 세포를 죽 일 수 있다 또는39그들의 확산 방지. Alzheimer의 질병40 타우 집계를 감소 하 고 유전자 변형 마우스 모델41,,4243에 관측 된 그것의 hyperphosphorylation를 방지 치료를 위한 리튬을 사용하실 수 있습니다. 44.
이 원고를 목표로: 1) 총 타우 및 치료 세포; 인 타우 식 레벨 측정 2) 측정 전체 타우 인 산화; 인산 가수분해 효소 분석 결과 설명 3) 검사의; microtubule 바인딩 그리고 4) 타우 confocal 현미경 검사 법 대 장 암 세포 라인 curcumin와 LiCl 치료 하 여 지역화. 결과 curcumin와 세포 치료, 대 장 암에 대 한 일 걸 요 좋은 화학요법 에이전트 그리고 LiCl 치료 두 총의 식을 줄일 수 있으며, 대 장 암 세포 라인에 타우 phosphorylated 공개. 이러한 치료의 핵 전 좌를 발생할 수 있습니다. 그러나, 예기치 않게, curcumin microtubules에의 바인딩 개선 실패 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고 총 타우 감지에 대 한 서로 다른 절차 조건 고 대 장 암 세포 치료 curcumin와 LiCl 타우 phosphorylated. 단백질 견본에서의 전반적인 인 산화 상태를 평가 하기 위해 인산 가수분해 효소 분석 결과 설명 했다. 이 분석 결과 잠재적으로 어떤 단백질의 인 산화 상태 검사를 사용할 수 있습니다.
이 분석 결과 phosphorylated 단백질 이동 비 phosphorylated 상태로 보다 원칙을 기반으로 합?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구 프로젝트의 일환 ‘개발 및 해양 미세에서 높은 가치 화장품 원료 물질의 산업화’ 라는, 지원 사역의 바다와 수 산, 한국, 그리고 교내 그랜트 (2Z04930)에 의해 지원 되었다 수행 되었다 KIST 강릉 연구소 천연 제품.
Materials
| HCT 116 cell | ATCC | CCL-247 | |
| MEM (EBSS) | Hyclone | SH30024.01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher (Gibco) | 16000044 | Store at -20 °C |
| penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA solution | WelGene | LS 015-01 | |
| 100 mm dish | Corning | 430161 | |
| 6 well plate | Corning | Coster 3516 | |
| Anti-Tau 13 antibody | abcam | ab19030 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Roche | 10 708 984 001 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microlitre Centrifuges | Hettich Zentrifugen | MIKRO 200 R | |
| Paclitaxel | Sigma-Aldrich | T1912 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Curcumin | Sigma-Aldrich (Fluka) | 78246 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microtubules (MT) | Cytoskeleton | MT001 | Store at 4 °C (desiccated) |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Store at 4 °C in the dark |
| Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Store at -20 °C |
| DPBS | WelGene | LB 001-02 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP | |
| PIPES | Sigma | P1851 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Molecular Imager | Bio-Rad | ChemiDoc XRS+ | Store at 4 °C |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
| α-tubulin (11H10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2125 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2118 | |
| Anti-Tau (phospho S396) antibody | abcam | ab109390 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | Store at room temperature |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | Store at -20 °C |
| PMSF | Sigma | P7626 | Store at room temperature |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5870 | Store at 4 °C |
| Protease Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5871 | Store at 4 °C |
| RIPA Buffer | Sigma | R 0278 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Tau-352 human | Sigma | T 9950 | Store at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X – 100 | Store at around 25 °C |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | |
| Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11005 | Store at 4 °C in the dark |
| Confocal Microscopy | Leica Microsystem | Leica TCS SP5 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 75819 | |
| Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Store at 4 °C |
Referenzen
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