リン酸化と大腸癌細胞におけるタウ蛋白の局在と微小管結合の試金
Summary
本稿では、測定、微小管と薬物治療に続く細胞内のタウのローカリゼーションのタウ結合タウ タウを測定するための標準プロトコルについて説明します。これらのプロトコルは、薬やタウ タウや微小管結合を対象とする他の化合物をスクリーニングするため繰り返し使用できます。
Abstract
微小管関連タンパク質 tau 主軸索に局在する神経蛋白質であります。一般的にタウの微小管重合と安定化になっているので正常な神経機能に不可欠です。ニューロンのほかにタウはひと乳癌、前立腺、胃、大腸、膵癌それはほぼ同じような構造を示していて、神経のタウとして同様の機能を発揮で表されます。タウとそのリン酸化の量は、微小管の安定剤としてその機能を変更でき、別の神経変性疾患、アルツハイマー病などのペアのヘリカル フィラメントの開発に 。タウとその微小管結合特性のリン酸化状態の判断が重要です。また、タウの細胞内の局在を調べることは、さまざまな病気で重要です。この原稿詳細標準プロトコル リン酸化タウとクルクミンと LiCl 治療の有無、大腸癌細胞の微小管のタウ バインディングを測定するため。これらの治療法は、癌細胞の増殖と開発を停止する使用ことができます。低量の抗体を使用している間免疫組織化学と共焦点顕微鏡を用いたタウの細胞内局在性を調べたこれらのアッセイは、タウ タウや微小管結合に影響を与える化合物をスクリーニングするため繰り返し使用できます。関連抗癌剤は可能性のあるこれらのプロトコルを使用して特徴付けられるまたは異なるタウオパチーの治療薬が使用されます。
Introduction
タウはもともと共同チューブリン1で精製した熱安定性微小管関連タンパク質として同定されました。タウは、高等真核生物2,3,4でのみ表されます。タウの主な機能は、微小管アセンブリ1,5,6を制御することです。また、微小管7、軸索輸送8、9軸索直径の変化、神経変性疾患10神経極性の形成の重合化に貢献します。タウは、いくつかのシグナル伝達経路を制御するタンパク質の足場としても機能します。ラット脳研究は、タウを提案するニューロン固有でありそれが主に軸索11に局在すること。中枢神経の軸索の開発で主要な役割を果たすタウ タウが微小管重合と神経の開発に不可欠な仮説この仮説は後の in vitroとin vivoの実験により確認します。ニューロンに加えタウは異なる非神経細胞、肝臓、腎臓、筋肉細胞12,13などで表されます。また、ひと乳癌、前立腺、大腸、胃、膵癌細胞ラインおよび組織14,15,16,17,18,タウを表現します。19. タウ封入体筋炎、封入体20のツイスト tubulofilaments として分かった。
タウは、いくつかの翻訳後修飾を運ぶことができます。すべてのポスト翻訳の修正のリン酸化が最も一般的です。増加 tau のリン酸化は、最終的に不安定細胞骨格微小管の親和性を減少します。80-5 リン酸化サイトは、タウ蛋白のヒトのアルツハイマー病脳組織から分離されたに記載されています。これらのサイトの 53% は唯一 6% チロシン残基21,22,2341% トレオニン、セリンを構成します。Tau のリン酸化に影響を与える他のポスト翻訳の修正には感受性と溶解バインディング機能局在化。正常範囲以上にも tau のリン酸化 (またはリン酸基を完全に飽和させる) アルツハイマー病24の構造と機能特性を複製するタウとして知られています。タウは、軸索の微小管の正常な機能維持し、確実に生理学的な条件の下で正常な神経機能します。ただし、過リン酸化タウが微小管分解のため神経細胞の損失の原因とよく組織化された微小管結合を維持するために失敗します。リン酸化タウの正常なレベルに必要機能、適切なタウが、タウがその特徴的なリン酸化レベルが変更される、過リン酸化25の場合正常に機能に失敗します。アルツハイマー病と他の加齢に伴う変性疾患、タウ過リン酸化になり、ペアのヘリカル フィラメントと原線維変化26,27を形成します。したがって、tau のリン酸化と微小管結合を決定するための方法が重要です。
加齢関連のがんの場合、大腸がんは 3 番目は最も頻繁両方の男性と女性の28の第 3 著名な死の原因となる癌を診断です。大腸癌は、西部の世界29の主な死の原因となる癌の一つです。大腸がんとアルツハイマー病は、高齢化に関連付けられているため、両方起こる主に先進国の人々 が同じような食生活を楽しむ 2 つの病気は相関何とか可能性があります。また、タウ陽性とタウ陰性の癌細胞は、化学療法剤、例えば、パクリタ キセル16に異なる対応します。
クルクミンは、ウコン、インド スパイス ウコン30の主要な誘導体の 1 つです。何世紀にも南アジア人口は日常的に彼らの食事療法でウコンを消費しています。クルクミンは大腸癌、アルツハイマー病、糖尿病、嚢胞性線維症、炎症性腸疾患、関節炎、高脂血症、動脈硬化症、虚血性心疾患31,を含む、さまざまな病気の治療に使用します。32,33,34,35,36,37,38. リチウムできますも大腸癌細胞を殺すか39彼らの増殖を防ぐ。リチウムは、タウ凝集が減り、、トランスジェニック マウス モデル41,42,43に見られるそのタウを防止、アルツハイマー病40の治療にも使用できます。 44。
この原稿を目指して: 1) 総タウと扱われた細胞内リン酸化タウ発現レベルを測定します。2); リン酸化タウ全体を測定する脱燐酸化酵素試金を記述します。3); タウの微小管結合を調べる・ 4) クルクミンまたは LiCl で治療した大腸癌細胞株における共焦点顕微鏡によるタウをローカライズします。結果では、クルクミンと細胞治療、大腸癌のためおそらく良い化学療法剤であるし、LiCl による治療両方の総タウの式を減らすことができます大腸癌細胞株におけるタウをリン酸化を明らかにします。これらの治療法は、タウの核内移行を引き起こすことも。しかし、突然、クルクミンはタウの微小管への結合を改善するために失敗します。
Protocol
Representative Results
Discussion
この原稿は、総タウを検出するためさまざまな手続き型条件を確立し、クルクミンと LiCl 大腸癌細胞で tau のリン酸化します。Tau 蛋白質のサンプルの全体のリン酸化状態を評価するために脱燐酸化酵素試金は記述されていた。この試金は、任意のタンパク質のリン酸化状態を調べる可能性があります使用できます。
この試金は非リン酸化状態より遅いタンパク質の動き?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究を行ったプロジェクトの一部タイトルの 『 開発と価値の高い化粧品原料海洋微細藻類からの工業化 』、省の海洋と水産、韓国、によって資金を供給、学内グラント (2Z04930) によって支えられました。天然物の KIST 陵所。
Materials
| HCT 116 cell | ATCC | CCL-247 | |
| MEM (EBSS) | Hyclone | SH30024.01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher (Gibco) | 16000044 | Store at -20 °C |
| penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA solution | WelGene | LS 015-01 | |
| 100 mm dish | Corning | 430161 | |
| 6 well plate | Corning | Coster 3516 | |
| Anti-Tau 13 antibody | abcam | ab19030 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Roche | 10 708 984 001 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microlitre Centrifuges | Hettich Zentrifugen | MIKRO 200 R | |
| Paclitaxel | Sigma-Aldrich | T1912 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Curcumin | Sigma-Aldrich (Fluka) | 78246 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microtubules (MT) | Cytoskeleton | MT001 | Store at 4 °C (desiccated) |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Store at 4 °C in the dark |
| Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Store at -20 °C |
| DPBS | WelGene | LB 001-02 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP | |
| PIPES | Sigma | P1851 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Molecular Imager | Bio-Rad | ChemiDoc XRS+ | Store at 4 °C |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
| α-tubulin (11H10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2125 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2118 | |
| Anti-Tau (phospho S396) antibody | abcam | ab109390 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | Store at room temperature |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | Store at -20 °C |
| PMSF | Sigma | P7626 | Store at room temperature |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5870 | Store at 4 °C |
| Protease Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5871 | Store at 4 °C |
| RIPA Buffer | Sigma | R 0278 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Tau-352 human | Sigma | T 9950 | Store at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X – 100 | Store at around 25 °C |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | |
| Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11005 | Store at 4 °C in the dark |
| Confocal Microscopy | Leica Microsystem | Leica TCS SP5 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 75819 | |
| Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Store at 4 °C |
Referenzen
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