Saggio per la fosforilazione e l'associazione dei microtubuli con localizzazione della proteina Tau in cellule di cancro del colon-retto
Summary
Questo manoscritto descrive protocolli standard per la misurazione iperfosforilazione di tau, associazione tau ai microtubuli e la localizzazione intracellulare Tau dopo trattamenti farmacologici di misura. Questi protocolli possono essere utilizzati in modo ripetitivo per lo screening di farmaci o altri composti che ottenere tau iperfosforilazione o dei microtubuli associazione.
Abstract
Il tau proteina microtubule-collegata è una proteina di un neurone che si localizza principalmente negli assoni. Generalmente il tau è essenziale per il normale funzionamento neuronale perché è coinvolto nella stabilizzazione e microtubuli. Oltre a neuroni, tau è espresso in umano del seno, prostata, gastrica, del colon-retto e cancri del pancreas dove Mostra struttura quasi simile ed esercita funzioni simili come il tau neuronale. La quantità di tau e sua fosforilazione può modificare la sua funzione come stabilizzatore dei microtubuli e portare allo sviluppo di filamenti elicoidali accoppiati in diversi processi neurodegenerativi, come il morbo di Alzheimer. Determinazione dello stato di fosforilazione di tau e le sue caratteristiche di microtubule-leganti è importante. Inoltre, esaminando la localizzazione intracellulare di tau è importante in diverse malattie. Questo manoscritto particolari protocolli standard per la misurazione di fosforilazione di tau e associazione tau i microtubuli in cellule di cancro colorettale con o senza curcumina e trattamento di LiCl. Questi trattamenti possono essere utilizzati per interrompere lo sviluppo e la proliferazione della cellula tumorale. Localizzazione intracellulare di tau è esaminati mediante immunoistochimica e microscopia confocale durante l’utilizzo di basse quantità di anticorpi. Queste analisi possono essere utilizzate ripetutamente per lo screening di composti che influenzano l’iperfosforilazione di tau o associazione dei microtubuli. Approcci terapeutici utilizzati per differenti Taupatie o relativi agenti anticancro potenzialmente possono essere caratterizzati tramite questi protocolli.
Introduction
Tau è stata originariamente identificata come una proteina microtubule-collegata di termo-stabile che è stato co-purificata con tubulina1. Tau è espresso esclusivamente in più alti eucarioti2,3,4. La funzione principale di tau è quello di controllare microtubule Assemblea1,5,6. Contribuisce anche alla polimerizzazione dei microtubuli7, trasporto assonale8, cambiamenti nel diametro assonale9, formazione di neuroma polarità e neurodegenerazione10. Tau funge anche da un’impalcatura di proteine per controllare alcune vie di segnalazione. Gli studi del cervello di ratto suggeriscono che tau è neurone-specifico e che localizza principalmente in assoni11. Perché tau è essenziale per la polimerizzazione dei microtubuli e sviluppo neuronale, tau è stata supposta per svolgere un ruolo importante nello sviluppo di axonal nel sistema nervoso centrale; Questa ipotesi è stato successivamente verificato da esperimenti in vitro e in vivo . Oltre ai neuroni, tau è espresso in cellule non neuronali differenti, compreso fegato, rene e muscolo cellule12,13. Tau è espresso anche in umano del seno, della prostata, del colon-retto, gastrica e cancro del pancreas cella linee e tessuti14,15,16,17,18, 19. tau si trova anche nella miosite come twisted tubulofilaments in corpi di inclusione20.
Tau può trasportare parecchie modifiche post-traduzionali. Di tutte le modifiche post-traduzionali, fosforilazione è il più comune. Fosforilazione di tau aumento diminuisce la sua affinità per i microtubuli, infine destabilizzare il citoscheletro. Siti di fosforilazione di ottantacinque sono stati descritti nella proteina tau isolato dai tessuti di cervello umano del morbo di Alzheimer. Di questi siti, 53% costituiscono serina, treonina 41% e solo 6% tirosina residui21,22,23. La fosforilazione di Tau influisce sulla sua localizzazione, funzione, associazione, solubilità e della sua suscettibilità ad altre modificazioni post-traduzionali. Anche la fosforilazione di tau a oltre la misura normale (o completamente saturo con gruppi fosfato) è conosciuto come iperfosforilazione che replica le caratteristiche strutturali e funzionali del morbo di Alzheimer24. Tau mantiene il corretto funzionamento dei microtubuli assonali e assicura il normale funzionamento neuronale in condizioni fisiologiche. Tuttavia, tau iperfosforilata non riesce a mantenere un’associazione ben organizzata dei microtubuli, causando la perdita di un neurone a causa di disassemblaggio dei microtubuli. Sono necessari per tau corretto funzionamento normali livelli di fosforilazione di tau, ma tau non riesce a funzionare normalmente se il livello di fosforilazione caratteristico è alterato e se è hyperphosphorylated25. Nel morbo di Alzheimer e di alcuni altri disordini neurodegenerative relativi all’età, tau diventa hyperphosphorylated e forma i filamenti elicoidali accoppiati e grovigli neurofibrillary26,27. Così, i metodi per determinare la fosforilazione di tau e associazione dei microtubuli sono importanti.
Cancro colorettale, un cancro di invecchiamento-collegato, è che il terzo più frequentemente diagnosticato cancro e il terzo cancro prominente di causa di morte per uomini e donne28. Il cancro colorettale è uno dei cancri più principali causa di morte nel mondo occidentale29. Perché sia cancro colorettale e morbo di Alzheimer sono associate con l’invecchiamento e sia capita soprattutto nei paesi sviluppati, dove le persone godono simili abitudini alimentari, le due malattie possono in qualche modo essere correlate. Inoltre, le cellule tumorali tau-positivi e negativi tau rispondono in modo diverso agli agenti chemioterapeutici, ad es., paclitaxel16.
La curcumina è uno dei principali derivati di Curcuma longa, la curcuma spezia indiana30. Per secoli, popolazioni sud asiatiche hanno consumato curcuma nella loro dieta su base giornaliera. La curcumina è usata per trattare diverse patologie, compreso cancro colorettale, morbo di Alzheimer, diabete, fibrosi cistica, malattie infiammatorie intestinali, artrite, iperlipidemia, aterosclerosi e malattia cardiaca ischemica31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. al litio può anche uccidere le cellule tumorali del colon-retto o prevenire la loro proliferazione39. Litio può essere utilizzato anche per il trattamento del morbo di Alzheimer40 come si diminuisce l’aggregazione di tau e impedisce la sua iperfosforilazione come osservato in un topo transgenico modello41,42,43, 44.
Questo manoscritto si propone di: 1) misurare la tau totale e livelli di espressione di phospho-tau in cellule trattate; 2) descrivere un’analisi della fosfatasi per misurare la fosforilazione di tau complessiva; 3) esaminare microtubule-leganti di tau; e 4) localizzare tau mediante microscopia confocale in linee cellulari di cancro colorettale trattate con curcumina o LiCl. I risultati rivelano che il trattamento delle cellule con la curcumina, che è un agente chemioterapeutico apparentemente buono per tumore del colon, e trattamento con LiCl può ridurre l’espressione di entrambi tau totale e fosforilato tau in linee cellulari di cancro colorettale. Questi trattamenti possono anche causare la traslocazione nucleare di tau. Tuttavia, inaspettatamente, la curcumina non riesce a migliorare associazione di tau i microtubuli.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo manoscritto stabilito diverse condizioni procedurale per la rilevazione totale tau e fosforilato tau in cellule di cancro colorettale trattate con curcumina e LiCl. Per valutare lo stato generale di fosforilazione di tau nei campioni della proteina, è stata descritta un’analisi della fosfatasi. Questo test può potenzialmente utilizzabili per esaminare lo stato di fosforilazione di tutta la proteina.
Questa analisi è basata sul principio che fosforilato proteina mosse più lento del s…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata eseguita come parte del progetto dal titolo “Sviluppo e industrializzazione di alto valore materie prime cosmetiche da microalghe marine”, finanziato dal Ministero degli oceani e pesca, Corea e fu sostenuta da una sovvenzione intramurale (2Z04930) da KIST Gangneung Istituto di prodotti naturali.
Materials
| HCT 116 cell | ATCC | CCL-247 | |
| MEM (EBSS) | Hyclone | SH30024.01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher (Gibco) | 16000044 | Store at -20 °C |
| penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA solution | WelGene | LS 015-01 | |
| 100 mm dish | Corning | 430161 | |
| 6 well plate | Corning | Coster 3516 | |
| Anti-Tau 13 antibody | abcam | ab19030 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Roche | 10 708 984 001 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microlitre Centrifuges | Hettich Zentrifugen | MIKRO 200 R | |
| Paclitaxel | Sigma-Aldrich | T1912 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Curcumin | Sigma-Aldrich (Fluka) | 78246 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microtubules (MT) | Cytoskeleton | MT001 | Store at 4 °C (desiccated) |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Store at 4 °C in the dark |
| Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Store at -20 °C |
| DPBS | WelGene | LB 001-02 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP | |
| PIPES | Sigma | P1851 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Molecular Imager | Bio-Rad | ChemiDoc XRS+ | Store at 4 °C |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
| α-tubulin (11H10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2125 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2118 | |
| Anti-Tau (phospho S396) antibody | abcam | ab109390 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | Store at room temperature |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | Store at -20 °C |
| PMSF | Sigma | P7626 | Store at room temperature |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5870 | Store at 4 °C |
| Protease Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5871 | Store at 4 °C |
| RIPA Buffer | Sigma | R 0278 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Tau-352 human | Sigma | T 9950 | Store at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X – 100 | Store at around 25 °C |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | |
| Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11005 | Store at 4 °C in the dark |
| Confocal Microscopy | Leica Microsystem | Leica TCS SP5 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 75819 | |
| Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Store at 4 °C |
Referenzen
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