Chromatine protocole d’immunoprécipitation (puce) pour les échantillons embryonnaires de faible abondance
Summary
Nous décrivons ici une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et le protocole de préparation de bibliothèque de ChIP-seq pour générer des profils épigénomique global d’échantillons embryonnaires de poulet de faible abondance.
Abstract
Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une technique largement utilisée pour cartographier la localisation des histones modifiées post-traductionnellement, variants d’histones, facteurs de transcription ou des enzymes modifiant la chromatine à un locus donné ou sur une échelle de tout le génome. La combinaison de tests de puce avec génération de séquençage (c.-à-d., ChIP-Seq) est une approche puissante pour découvrir dans le monde des réseaux de régulation génique et améliorer l’annotation fonctionnelle des génomes, en particulier des séquences régulatrices non codantes. Puce protocoles nécessitent généralement de grandes quantités de matériel cellulaire, ce qui annule l’applicabilité de cette méthode à une enquête sur les types de cellules rares ou des biopsies tissulaires petit. Afin de rendre l’analyse de puce compatible avec la quantité de matières biologiques qui en général peuvent être obtenus in vivo au cours de l’embryogenèse précoce de vertébrés, les auteurs décrivent ici un protocole simplifié de puce dans lequel le nombre d’étapes nécessaires pour terminer le test ont été réduits pour minimiser la perte de l’échantillon. Ce protocole ChIP a été utilisé avec succès pour enquêter sur des modifications d’histone différentes dans différents poulet embryonnaire et les tissus de souris adulte moyen faible pour un nombre moyen de cellules (5 x 104 – 5 x 105 cellules). Surtout, ce protocole est compatible avec la technologie ChIP-seq, à l’aide de méthodes de préparation de la bibliothèque standard, fournissant ainsi l’épigénomique global cartes dans les tissus embryonnaires très pertinents.
Introduction
Modifications post-traductionnelles des histones sont directement impliquées dans divers processus dépendants de chromatine, y compris la transcription, de réplication et de réparation de l’ADN pour1,2,3. En outre, les modifications d’histone différents montrent positifs (par exemple, H3K4me3 et H3K27ac) ou négatif (par exemple, H3K9me3 et H3K27me3) corrélations avec l’expression du gène et peuvent être définis de façon large comme marque d’histone activant ou répressive, respectivement2,3. Par conséquent, cartes de modification globale histone, également appelées cartes épigénomique, sont apparus comme des outils puissants et universels d’annoter fonctionnellement des génomes de vertébrés4,5. Par exemple, les séquences régulatrices distales comme exhausteurs peuvent être identifiés basé sur des signatures spécifiques de chromatine (p. ex., active exhausteurs : H3K4me1 et H3K27ac), qui les distinguent des régions promotrices proximal (par exemple, promoteurs actifs : H3K4me3)6,7,8. En revanche, gènes avec fonctions réglementaires d’identité cellulaire majeur se trouvent généralement avec les domaines de la chromatine large marquées avec H3K4me3 ou H3K27me3, suivant l’État transcriptionnellement actif ou inactif des gènes sous-jacent, respectivement9 ,,10. De même, l’expression des gènes d’identité cellulaire majeure semble être fréquemment contrôlée par de multiples et dans l’espace en cluster exhausteurs (c.-à-d., les exhausteurs de Super), qui peuvent être identifiés comme grands domaines marqués H3K27ac11.
Actuellement, modification des histones cartes sont générées en utilisant la technologie ChIP-seq, qui, par rapport aux approches précédentes telles que ChIP-chip (puce couplée à des puces à ADN), offre une résolution plus élevée, moins d’artefacts, moins de bruit, la couverture supérieure et inférieure frais12. Néanmoins, la génération de cartes épigénomique utilisant la technologie ChIP-seq a ses limites inhérentes, surtout associés à la capacité de réaliser avec succès la puce dans les échantillons d’intérêt. Protocoles de puce traditionnels généralement requis des millions de cellules, qui limite l’applicabilité de cette méthode pour cellulaire in vitro des lignes ou des cellules qui peut facilement être isolés en vivo (par exemple, les cellules sanguines). Dans ces dernières années, un certain nombre de mis à jour le protocoles de puce compatibles avec un nombre faible de cellules ont été décrits13,14,15,16. Toutefois, ces protocoles sont spécifiquement conçus pour être couplé avec la nouvelle génération séquençage (c.-à-d., ChIP-seq), et ils utilisent généralement ad hoc bibliothèque préparation méthodes13,14, 15 , 16.
Ici, nous avons décrit un protocole de puce qui peut être utilisé pour étudier les profils de modification d’histone en utilisant le nombre de cellules faible à intermédiaire (5 x 104 – 5 x 105 cellules) locus soit sélectionné (c’est-à-dire, ChIP-qPCR) ou dans le monde (par exemple, ChIP-seq) (Figure 1). Lorsqu’il est couplé à la technologie ChIP-seq, notre protocole de puce peut être utilisé ainsi que les méthodes de préparation de bibliothèque standard, ce qui le rend largement accessible à de nombreux laboratoires10. Ce protocole a été utilisé pour étudier plusieurs marques d’histone (par exemple, H3K4me3, H3K27me3 et H3K27ac) dans les tissus embryonnaires de poulet différentes (par exemple, la colonne vertébrale du tube neural (SNT), fronto proéminences et épiblaste). Cependant, nous pensons qu’il devrait être largement applicable à d’autres organismes qui échantillons biologique et/ou cliniquement pertinentes peuvent être obtenus seulement en faibles quantités.
Protocol
Representative Results
Discussion
Épigénomique profilage de modification d’histone à l’aide de ChIP-seq peut être utilisé pour améliorer l’annotation fonctionnelle des génomes de vertébrés dans différents contextes cellulaire4,5,18. Ces profils épigénomique peuvent être utilisés, entre autres, d’identifier les éléments d’enhancer, pour définir l’État réglementaire des activateurs (c’est-à-dire actif, apprêtée, ou sur le…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Jan Appel pour son excellente assistance technique lors de la mise en place du présent protocole. Travail dans le laboratoire de Rada-Iglesias est pris en charge par CMMC intra-muros financement, subventions de recherche du DFG (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1 et TE 1007/3-1), le chercheur avancé UoC groupe Grant et l’octroi de CECAD.
Materials
| Reagent | |||
| BSA powder | Carl Roth | 3737.3 | |
| Phosphate Saline buffer (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Tris-HCL pH8.0 | Sigma Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.2 | |
| Na-Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-24 | |
| N-lauroylsarcosine | Sigma Aldrich | 61743-25G | |
| Hepes | Applichem | A3724,0250 | |
| LiCl | Carl Roth | 3739.2 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I3021-100ml | |
| SDS | Carl Roth | 1833 | |
| Protein G/magnetic beads | Invitrogen | 1004D | |
| 37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-1L | |
| Glycine | |||
| RNase | Peqlab | 12-RA-03 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 46.35 E | |
| Na-butyrate | Sigma Aldrich | SLB2659V | |
| Proteinase inhibitor | Roche | 5892791001 | |
| SYBRgreen Mix | biozym | 617004 | |
| dH2O | Sigma Aldrich | W4502 | |
| 1Kb ladder | Thermofisher | SM1333 | |
| Orange G | Sigma Alrich | 03756-25 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-072 | |
| Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100) | Roth | 3051.4 | |
| DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) | Gibco | 31331-028 | |
| Gel loading tips Multiflex | A.Hartenstein | GS21 | |
| qPCR Plates | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 384 well | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 1.5 mL tubes | Sarstedt | 72,706 | |
| 100-1000µl Filter tips | Sarstedt | 70,762,211 | |
| 2-20µl Filter tips | Sarstedt | 70,760,213 | |
| 2-200µl Filter tips | Sarstedt | 70,760,211 | |
| 0.5-10µl Filter tips | Sarstedt | 701,116,210 | |
| H3K27me3 antibody | Active Motif | 39155 | |
| H3K27ac antibody | Active Motif | 39133 | |
| H3K4me3 antibody | Active Motif | 39159 | |
| H3K4me2 antibody | Active Motif | 39141 | |
| End Repair Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Paramagnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Resuspension buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| A-Tailing Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Ligation Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| RNA Adapter Indexes | Illumina | RS-122-2101 | |
| Stop Ligation Buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| PCR Primer Cocktail | Illumina | FC-121-4001 | |
| Enhanced PCR Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Genomic DNA ladder | Agilent | 5067-5582 | |
| Elution Buffer | Agilent | 19086 | |
| Sample Buffer | Agilent | 5067-5582 | |
| Library Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4835 – 07960204001 | |
| Fertile chicken white eggs | LSL Rhein Main | KN: 15968 | |
| Needle (Neoject) | A.Hartenstein | 10001 | |
| Syringe (Ecoject 10ml) | Dispomed witt oHG | 21010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Hermle | Z 216 MK | |
| Thermoshaker | ITABIS | MKR13 | |
| Sonicator | Active Motive | EpiShear probe sonicator | |
| Sonicator | Diagenode | Bioruptor Plus | |
| Rotator | Stuart | SB3 | |
| Variable volume (5–1,000 μl) pipettes | Eppendorf | N/A | |
| Timer | Sigma | N/A | |
| Magnetic holder | Thermo Fisher | DynaMag-2 12321D | |
| Table spinner | Heathrow Scientific | Sprout | |
| Mixer | LMS | VTX 3000L | |
| Real-Time PCR Cycler | Roche | Light Cycler; Serial Nr.5662 | |
| PCR Cycler | Applied Biosystems | Gene Amp PCR System 9700 | |
| DNA and RNA quality control system | Agilent | Agilent 4200 TapeStation System | |
| Forceps | Dumont | 5-Inox-H | |
| Perforated spoon | World precision instruments | 501997 |
Referenzen
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