Протокол иммунопреципитации (чип) Chromatin для Low изобилие эмбриональных образцов
Summary
Здесь мы описываем иммунопреципитации chromatin (обломока) и чип seq библиотека подготовки протокола для создания глобального epigenomic профили из эмбриональных образцов куриного низким изобилие.
Abstract
Иммунопреципитации Chromatin (обломока) — это метод широко используется для сопоставления локализации post-translationally модифицированных гистонов, гистонов варианты, факторов транскрипции или chromatin изменения ферментов в данном локусе или геном масштабе. Сочетание чип анализов с следующего поколения последовательности (то есть чип-Seq) представляет собой мощный подход глобально раскрыть генных сетей регулирования и улучшения функционального Аннотация геномов, особенно некодирующих последовательностей регулирования. Протоколы обломока обычно требуют большого количества клеточным материалом, исключая, таким образом, применимость данного метода расследованию типы редких клеток или биопсии малых тканей. Для того, чтобы сделать пробирного чип совместим с количество биологического материала, которые обычно могут быть получены в естественных условиях в раннем эмбриогенезе позвоночных, опишем здесь упрощенный протокол чип, в котором количество шагов, необходимых для завершения пробы были сокращены свести к минимуму потери образца. Этот чип протокол успешно использовался для изучения различных гистона изменения в различных эмбриональные куриные и тканей взрослой мыши с помощью низкого числа средних клеток (5 х 104 – 5 x 105 клеток). Важно отметить, что этот протокол совместим с чип seq технологии с использованием методов подготовки стандартной библиотеки, обеспечивая тем самым глобальное epigenomic карты в весьма актуальным эмбриональных тканей.
Introduction
Столб-поступательные изменения гистона непосредственно участвуют в различных хроматина зависимых процессов, включая транскрипции и репликации ДНК ремонт1,2,3. Кроме того, различные гистона изменения показывают положительные (например, H3K4me3 и H3K27ac) или отрицательным (например, H3K9me3 и H3K27me3) корреляции с экспрессии генов и может быть широко определены как активация или репрессивных гистона метки, соответственно2,3. Следовательно глобальные гистона модификации карты, также упоминается как epigenomic карты, превратились в мощные и универсальные инструменты функционально аннотировать позвоночных геномов4,5. Например, дистальная регулирования последовательности такие как усилители могут быть определены основаны на наличие конкретных хроматина подписи (например, Активные расширители: H3K4me1 и H3K27ac), которые отличают их от проксимальных промоутер регионов (например, активных промоутеров: H3K4me3)6,,78. С другой стороны гены с крупных клеток личность регулирующих функций обычно встречаются с широким хроматина доменов, отмеченные H3K4me3 или H3K27me3, в зависимости от транскрипционно активным или неактивным статус основных генов, соответственно9 ,10. Аналогично выражение основных клеток идентификации генов кажется, часто контролироваться многочисленными и пространственно кластерного усилители (т.е., супер-усилители), которые могут быть определены как широкий H3K27ac-отмечен доменов11.
В настоящее время изменения гистона карты создаются с помощью чип seq технологию, которая по сравнению с предыдущих подходов, таких как чип микросхема (чип в сочетании с microarrays) обеспечивает более высокое разрешение, меньше артефактов, меньше шума, большего охвата и нижнего 12расходы. Тем не менее поколение epigenomic карт с помощью технологии ChIP-seq имеет свои присущие ограничения, главным образом связанные с успешно выполнять чип в образцах, представляющих интерес. Традиционные протоколы обломока обычно требуются миллионы клеток, который предел применимости этого метода в пробирке клеток линии или клетки, которые могут быть легко изолированных в естественных условиях (например, клетки крови). В последние несколько лет количество измененных протоколы обломока, совместимый с низкой сотовый номера были описаны13,14,,1516. Однако эти протоколы специально разработаны, чтобы быть в сочетании с следующего поколения последовательности (то есть чип seq), и они обычно используется Специальная библиотека подготовка методы13,14, 15 , 16.
Здесь, мы описали чип протокол, который может использоваться для расследования гистона модификации профилей с помощью числа низкой для промежуточных клеток (5 х 104 – 5 x 105 клеток) либо отдельных локусах (т.е., чип ПЦР) или глобально (т.е. Чип seq) (рис. 1). При сочетании технологию чип seq, наш чип протокол может использоваться вместе с методами подготовки стандартной библиотеки, таким образом делая его широко доступными для многих лаборатории10. Этот протокол был использован для изучения нескольких меток гистона (например, H3K4me3, H3K27me3 и H3K27ac) в различных курица эмбриональных тканях (например, спинного нервной трубки (СНТ), лобно протуберанцы и Эпибласт). Однако мы ожидаем, что он должен быть широко применим для других организмов, в которых биологически или клинически соответствующие образцы можно только получить в малых количествах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epigenomic профилирования гистона модификации с помощью чип seq могут использоваться для улучшения функциональной заметки позвоночных геномов различных клеточных контекстах4,5,18. Эти профили epigenomic может использоваться, среди прочего, для в?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Ян Аппель за его прекрасную техническую помощь при создании этого протокола. Работа в лаборатории рада-Иглесиас поддерживается CMMC очных финансирования, DFG исследовательских грантов (RA 2547/1-1, РА 2547/2-1 и TE 1007/3-1), Грант и Грант CECAD УПЦ передовых исследователь группы.
Materials
| Reagent | |||
| BSA powder | Carl Roth | 3737.3 | |
| Phosphate Saline buffer (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Tris-HCL pH8.0 | Sigma Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.2 | |
| Na-Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-24 | |
| N-lauroylsarcosine | Sigma Aldrich | 61743-25G | |
| Hepes | Applichem | A3724,0250 | |
| LiCl | Carl Roth | 3739.2 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I3021-100ml | |
| SDS | Carl Roth | 1833 | |
| Protein G/magnetic beads | Invitrogen | 1004D | |
| 37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-1L | |
| Glycine | |||
| RNase | Peqlab | 12-RA-03 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 46.35 E | |
| Na-butyrate | Sigma Aldrich | SLB2659V | |
| Proteinase inhibitor | Roche | 5892791001 | |
| SYBRgreen Mix | biozym | 617004 | |
| dH2O | Sigma Aldrich | W4502 | |
| 1Kb ladder | Thermofisher | SM1333 | |
| Orange G | Sigma Alrich | 03756-25 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-072 | |
| Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100) | Roth | 3051.4 | |
| DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) | Gibco | 31331-028 | |
| Gel loading tips Multiflex | A.Hartenstein | GS21 | |
| qPCR Plates | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 384 well | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 1.5 mL tubes | Sarstedt | 72,706 | |
| 100-1000µl Filter tips | Sarstedt | 70,762,211 | |
| 2-20µl Filter tips | Sarstedt | 70,760,213 | |
| 2-200µl Filter tips | Sarstedt | 70,760,211 | |
| 0.5-10µl Filter tips | Sarstedt | 701,116,210 | |
| H3K27me3 antibody | Active Motif | 39155 | |
| H3K27ac antibody | Active Motif | 39133 | |
| H3K4me3 antibody | Active Motif | 39159 | |
| H3K4me2 antibody | Active Motif | 39141 | |
| End Repair Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Paramagnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Resuspension buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| A-Tailing Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Ligation Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| RNA Adapter Indexes | Illumina | RS-122-2101 | |
| Stop Ligation Buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| PCR Primer Cocktail | Illumina | FC-121-4001 | |
| Enhanced PCR Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Genomic DNA ladder | Agilent | 5067-5582 | |
| Elution Buffer | Agilent | 19086 | |
| Sample Buffer | Agilent | 5067-5582 | |
| Library Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4835 – 07960204001 | |
| Fertile chicken white eggs | LSL Rhein Main | KN: 15968 | |
| Needle (Neoject) | A.Hartenstein | 10001 | |
| Syringe (Ecoject 10ml) | Dispomed witt oHG | 21010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Hermle | Z 216 MK | |
| Thermoshaker | ITABIS | MKR13 | |
| Sonicator | Active Motive | EpiShear probe sonicator | |
| Sonicator | Diagenode | Bioruptor Plus | |
| Rotator | Stuart | SB3 | |
| Variable volume (5–1,000 μl) pipettes | Eppendorf | N/A | |
| Timer | Sigma | N/A | |
| Magnetic holder | Thermo Fisher | DynaMag-2 12321D | |
| Table spinner | Heathrow Scientific | Sprout | |
| Mixer | LMS | VTX 3000L | |
| Real-Time PCR Cycler | Roche | Light Cycler; Serial Nr.5662 | |
| PCR Cycler | Applied Biosystems | Gene Amp PCR System 9700 | |
| DNA and RNA quality control system | Agilent | Agilent 4200 TapeStation System | |
| Forceps | Dumont | 5-Inox-H | |
| Perforated spoon | World precision instruments | 501997 |
Referenzen
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K. Characterization of human epigenomes. Curr Opin. Genet Dev. 19 (2), 127-134 (2009).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Benayoun, B. A., et al. H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency. Cell. 158 (3), 673-688 (2014).
- Rehimi, R., et al. Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations. Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).
- Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).
- Ho, J. W. K., et al. Comparative analysis of metazoan chromatin organization. Nature. 512 (7515), 449-452 (2014).
- Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why?. Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
- Spitz, F., Furlong, E. E. M. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
