Cromatina (ChIP) de la inmunoprecipitación protocolo para muestras embrionarias baja abundancia
Summary
Aquí, describimos una inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y el protocolo de preparación de biblioteca de ChIP-seq para generar perfiles de epigenómica global de muestras embrionarias de pollo baja abundancia.
Abstract
Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es una técnica ampliamente utilizada para el mapeo de la localización de modificación postraduccional de las histonas, variantes de las histonas, factores de transcripción o enzimas modificadores de la cromatina en un locus determinado o en una escala genoma-ancha. La combinación de ensayos de ChIP con secuenciación de próxima generación (es decir, ChIP-Seq) es un enfoque poderoso para descubrir todo el mundo redes reguladoras del gene y para mejorar la anotación funcional del genoma, especialmente de secuencias reguladoras no codificantes. Protocolos de chIP normalmente requieren grandes cantidades de material celular, así que la aplicabilidad de este método a la investigación de tipos raros de la célula o biopsias de tejido pequeño. Para hacer el ensayo de ChIP compatible con la cantidad de material biológico que se puede obtener normalmente en vivo durante la embriogénesis temprana de vertebrados, se describe aquí un protocolo simplificado de ChIP en el que el número de pasos necesarios para completar la ensayo fueron reducidas para minimizar la pérdida de muestra. Este protocolo de ChIP se ha utilizado con éxito para investigar modificaciones de las histonas diferentes en varios embrionario pollo y ratón adulto tejidos utilizando baja a un número medio de células (5 x 104 – 5 x 105 células). Lo importante, este protocolo es compatible con la tecnología ChIP-seq con métodos de preparación de la biblioteca estándar, proporcionando epigenómica global mapas en tejidos embrionarios muy relevantes.
Introduction
Modificaciones post-traduccionales de las histonas están directamente involucradas en diversos procesos dependiente de la cromatina, incluyendo transcripción, replicación y reparación de ADN1,2,3. Además, modificaciones de las histonas diferentes muestran positivos (por ejemplo, H3K4me3 y H3K27ac) o negativo (por ejemplo, H3K9me3 y H3K27me3) correlaciones con la expresión de genes y puede ser definido ampliamente como marcas de activación o represión de la histona, respectivamente2,3. En consecuencia, los mapas de modificación global de la histona, también conocidos como mapas epigenómicos, han surgido como herramientas poderosas y universales para funcionalmente anotar genomas vertebrados4,5. Por ejemplo, secuencias reguladoras distales como potenciadores pueden ser identificados basan en la presencia de firmas de cromatina específicos (por ejemplo, activos potenciadores: H3K4me1 y H3K27ac), que distinguen de las regiones del promotor proximal (por ejemplo, promotores activos: H3K4me3)6,7,8. Por otra parte, los genes con funciones reguladoras de la identidad de células grandes suelen encontrarse con dominios de cromatina amplio marcados con H3K4me3 o H3K27me3, dependiendo del estado transcripcionalmente activo o inactivo de los genes subyacentes, respectivamente9 ,10. Del mismo modo, la expresión de los genes de identidad principales de la célula parece ser controlados con frecuencia por múltiples y espacialmente agrupados potenciadores (es decir, súper potenciadores), que pueden ser identificados como amplios dominios marcados H3K27ac11.
En la actualidad, histona modificación mapas son generados usando la tecnología de ChIP-seq, que en comparación con los anteriores enfoques como ChIP-chip (ChIP juntada a microarrays) proporciona mayor resolución, menos artefactos, menos ruido, mayor cobertura y menor cuesta12. Sin embargo, la generación de los mapas epigenómicos utilizando la tecnología de ChIP-seq tiene sus limitaciones inherentes, sobre todo asociadas a la capacidad para realizar con éxito el ChIP en las muestras de interés. Protocolos de ChIP tradicionales típicamente requieren millones de células, que limitan la aplicabilidad de este método a celular in vitro de líneas o células que puede ser fácilmente aisladas en vivo (por ejemplo, las células de sangre). En los últimos años, un número de protocolos modificados de ChIP compatibles con un número bajo de células ha sido descritas13,14,15,16. Sin embargo, estos protocolos están diseñados para acoplarse con secuenciación de próxima generación (es decir, ChIP-seq), y por lo general utilizan ad hoc biblioteca preparación métodos13,14, 15 , 16.
Aquí, hemos descrito un protocolo de ChIP que puede utilizarse para investigar perfiles de modificación de histonas mediante un número bajo a intermedio de células (5 x 104 – 5 x 105 células) en cualquiera de los dos loci seleccionados (es decir, ChIP-qPCR) o global (, es decir, ChIP-seq) (figura 1). Cuando se acopla a la tecnología ChIP-seq, nuestro protocolo de ChIP puede utilizarse junto con métodos de preparación de la biblioteca estándar, por lo que es ampliamente accesible a muchos laboratorios10. Este protocolo se ha utilizado para investigar varias marcas de histona (p. ej., H3K4me3, H3K27me3 y H3K27ac) en los tejidos embrionarios de pollo diferentes (p. ej., tubo neural espinal (SNT), prominencias frontonasal y epiblasto). Sin embargo, esperamos que sea ampliamente aplicable a otros organismos en que biológicamente o clínicamente relevantes muestras pueden obtenerse solamente en cantidades bajas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epigenómica perfiles de modificación de las histonas con ChIP-seq pueden utilizarse para mejorar la anotación funcional de genomas vertebrados en diferentes contextos celulares4,5,18. Estos perfiles epigenómica pueden utilizarse, entre otras cosas, para identificar elementos de reforzador, para definir el estado regulador de potenciadores (es decir, activo, preparado, o preparada) y definir los reguladores de identi…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Jan Appel por su excelente asistencia técnica durante el establecimiento de este protocolo. Trabajo en el laboratorio de Rada-Iglesias es apoyado por CMMC intramuros financiación, becas de investigación de la DFG (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1 y TE 1007/3-1), el investigador avanzado UoC grupo Grant y la beca del CECAD.
Materials
| Reagent | |||
| BSA powder | Carl Roth | 3737.3 | |
| Phosphate Saline buffer (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Tris-HCL pH8.0 | Sigma Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.2 | |
| Na-Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-24 | |
| N-lauroylsarcosine | Sigma Aldrich | 61743-25G | |
| Hepes | Applichem | A3724,0250 | |
| LiCl | Carl Roth | 3739.2 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I3021-100ml | |
| SDS | Carl Roth | 1833 | |
| Protein G/magnetic beads | Invitrogen | 1004D | |
| 37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-1L | |
| Glycine | |||
| RNase | Peqlab | 12-RA-03 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 46.35 E | |
| Na-butyrate | Sigma Aldrich | SLB2659V | |
| Proteinase inhibitor | Roche | 5892791001 | |
| SYBRgreen Mix | biozym | 617004 | |
| dH2O | Sigma Aldrich | W4502 | |
| 1Kb ladder | Thermofisher | SM1333 | |
| Orange G | Sigma Alrich | 03756-25 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-072 | |
| Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100) | Roth | 3051.4 | |
| DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) | Gibco | 31331-028 | |
| Gel loading tips Multiflex | A.Hartenstein | GS21 | |
| qPCR Plates | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 384 well | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 1.5 mL tubes | Sarstedt | 72,706 | |
| 100-1000µl Filter tips | Sarstedt | 70,762,211 | |
| 2-20µl Filter tips | Sarstedt | 70,760,213 | |
| 2-200µl Filter tips | Sarstedt | 70,760,211 | |
| 0.5-10µl Filter tips | Sarstedt | 701,116,210 | |
| H3K27me3 antibody | Active Motif | 39155 | |
| H3K27ac antibody | Active Motif | 39133 | |
| H3K4me3 antibody | Active Motif | 39159 | |
| H3K4me2 antibody | Active Motif | 39141 | |
| End Repair Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Paramagnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Resuspension buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| A-Tailing Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Ligation Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| RNA Adapter Indexes | Illumina | RS-122-2101 | |
| Stop Ligation Buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| PCR Primer Cocktail | Illumina | FC-121-4001 | |
| Enhanced PCR Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Genomic DNA ladder | Agilent | 5067-5582 | |
| Elution Buffer | Agilent | 19086 | |
| Sample Buffer | Agilent | 5067-5582 | |
| Library Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4835 – 07960204001 | |
| Fertile chicken white eggs | LSL Rhein Main | KN: 15968 | |
| Needle (Neoject) | A.Hartenstein | 10001 | |
| Syringe (Ecoject 10ml) | Dispomed witt oHG | 21010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Hermle | Z 216 MK | |
| Thermoshaker | ITABIS | MKR13 | |
| Sonicator | Active Motive | EpiShear probe sonicator | |
| Sonicator | Diagenode | Bioruptor Plus | |
| Rotator | Stuart | SB3 | |
| Variable volume (5–1,000 μl) pipettes | Eppendorf | N/A | |
| Timer | Sigma | N/A | |
| Magnetic holder | Thermo Fisher | DynaMag-2 12321D | |
| Table spinner | Heathrow Scientific | Sprout | |
| Mixer | LMS | VTX 3000L | |
| Real-Time PCR Cycler | Roche | Light Cycler; Serial Nr.5662 | |
| PCR Cycler | Applied Biosystems | Gene Amp PCR System 9700 | |
| DNA and RNA quality control system | Agilent | Agilent 4200 TapeStation System | |
| Forceps | Dumont | 5-Inox-H | |
| Perforated spoon | World precision instruments | 501997 |
Referenzen
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