낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜
Summary
여기, 우리는 chromatin immunoprecipitation (칩) 및 칩 seq 라이브러리 준비 프로토콜 낮은 풍부한 닭 배아 샘플에서 글로벌 epigenomic 프로 파일 생성을 설명 합니다.
Abstract
Chromatin immunoprecipitation (칩) post-translationally 수정된 히스톤, 히스톤 변형, 녹음 방송 요인, 또는 주어진된 장소에서 또는 게놈 넓은 규모로 chromatin 수정 효소의 지역화를 매핑하기 위한 널리 사용 기법입니다. 다음-세대 시퀀싱 (즉, 칩 Seq) 칩 분석 실험의 조합 세계적으로 유전자 규제 네트워크를 폭로 하 고 특히 비 코딩 규제 시퀀스의 유전자의 기능 주석 개선 하기 강력한 접근 이다. 칩 프로토콜은 일반적으로 많은 양의 세포 소재, 따라서 희귀 세포 유형 또는 작은 조직 생 검 조사 하는 것이 방법의 적용 제외 필요 합니다. 칩 분석 결과 얻어질 수 있는 일반적으로 생체 내에서 초기 척추 embryogenesis 동안 생물 학적 물질의 양을와 호환을 위해 여기 있는 단계 수를 완료 하는 데 필요한 간단한 칩 프로토콜 설명 합니다 분석 결과 샘플 손실을 최소화 하기 위해 감소 했다. 이 칩 프로토콜은 다양 한 배아 닭고기와 성인 마우스 조직 낮은 중간 셀 숫자 (5 x 104 -5 x 105 셀)를 사용 하 여 다른 히스톤 수정 조사를 성공적으로 사용 되었습니다. 중요 한 것은,이 프로토콜은 표준 라이브러리 준비 방법을 사용 하 여 칩 seq 기술과 호환, 관련성이 높은 배아 조직에 지도 글로벌 epigenomic 제공.
Introduction
히스톤 포스트 번역 상 수정 녹음 방송, 복제 및 DNA 복구1,2,3를 포함 하 여 다양 한 chromatin 종속 프로세스에 직접 참여 하는. 또한, 다른 히스톤 수정 보여 긍정적인 (예를 들어, H3K4me3 및 H3K27ac) 또는 음수 (예를 들어, H3K9me3 및 H3K27me3) 유전자 발현 상관 관계 광범위 하 게 정의 될 수 있는 활성화 또는 억압 적인 히스톤 표시로 각각2,은3. 따라서, 글로벌 히스톤 수정 지도, epigenomic 지도 라고도 기능적으로 척 추가 있는 게놈4,5주석을 강력 하 고 보편적인 도구로 떠오르고 있다. 예를 들어 원심 규제 시퀀스와 같은 강화를 확인할 수 있습니다에 따라 특정 chromatin 서명의 존재 (예를 들어, 활성 강화: H3K4me1 및 H3K27ac)는 근 위 발기인 지구에서 그들을 구분 (예를 들어, 활성 발기인: H3K4me3)6,,78. 다른 한편으로, 정체성 규정 하는 주요한 세포 기능을 가진 유전자는 일반적으로 넓은 chromatin 도메인 기본 유전자의 transcriptionally 활성 또는 비활성 상태에 따라 H3K4me3 또는 H3K27me3, 각각 표시 된9 발견 ,10. 마찬가지로, 주요 셀 정체성 유전자의 표현을 자주 여러 고 공간적 제어를 클러스터 강화 (즉, 슈퍼 강화), 광범위 한 H3K27ac 표시 된 도메인11로 확인 될 수 있다 보인다.
현재, 히스톤 수정 지도 칩 (칩 microarrays 결합) 같은 이전 방법에 비해 더 적은 소음, 큰 범위, 및 낮은 적은 유물 높은 해상도 제공 하는 칩 seq 기술을 사용 하 여 생성 됩니다. 비용12. 그럼에도 불구 하 고, epigenomic 맵 칩 seq 기술을 사용 하 여 생성의 한계, 주로 관심의 샘플에서 칩을 성공적으로 수행 하는 능력을 연관 있다. 전통적인 칩 프로토콜은 일반적으로 수백만의 세포를 체 외에서 세포를이 방법의 적용 라인 또는 세포는 제한 쉽게 격리 수 vivo에서 (예를 들어, 혈액 세포) 필요 합니다. 지난 몇 년 동안, 여러 수정된 칩 프로토콜 낮은 셀 숫자와 호환 설명된13,14,,1516되었습니다. 그러나, 이러한 프로토콜은 다음-세대 시퀀싱 (즉, 칩 seq)와 결합 하도록 특별히 설계 된 그리고 그들은 일반적으로 임시 라이브러리 준비 방법13,14, 를 사용 하 여 15 , 16.
여기, 우리는 히스톤 수정 프로필 중간에 낮은 셀 숫자 (5 x 104 -5 x 105 셀)를 사용 하 여 조사 하는 데 사용할 수 있는 칩 프로토콜 설명 (즉, 칩 정량) 중 선택한 loci 또는 전역 (즉, 칩 seq) (그림 1). 칩 seq 기술 결합 때 우리의 칩 프로토콜 표준 라이브러리 준비 방법, 따라서 많은 실험실10에 광범위 하 게 액세스할 수 있도록 함께 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 여러 히스톤 부호를 조사 하기 위해 사용 되었습니다 (예를 들어, H3K4me3, H3K27me3, 및 H3K27ac) 다른 닭 배아 조직 (예를 들어, 척추 신경 관 (SNT), frontonasal 굴지, 및 epiblast)에. 그러나, 우리는 그것은 다른 유기 체는 생물학적 및 임상 관련 샘플만 얻을 수 낮은 금액에 광범위 하 게 적용 해야 예상.
Protocol
Representative Results
Discussion
다른 세포질 문맥4,,518에 척 추가 있는 게놈의 기능적인 주석을 개선 하기 위해 Epigenomic의 히스톤 수정 칩 seq를 사용 하 여 프로 파일링을 사용할 수 있습니다. 이러한 epigenomic 프로필 사용할 수 있습니다, 다른 것 들 중, 증강 요소, (즉, 활성, 준비, 또는 태세), 강화의 규제 상태를 정의 하 고 다른 생물에 주요 셀 정체성 ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는이 프로토콜의 설립 동안에 그의 우수한 기술 지원에 대 한 1 월 Appel 감사합니다. Rada Iglesias 실험실에서 작업 CMMC 교내에서 지원 자금, DFG 연구 보조금 (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1, 그리고 테 1007/3-1), UoC 고급 연구원 그룹 그랜트, 그리고 CECAD 그랜트.
Materials
| Reagent | |||
| BSA powder | Carl Roth | 3737.3 | |
| Phosphate Saline buffer (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Tris-HCL pH8.0 | Sigma Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.2 | |
| Na-Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-24 | |
| N-lauroylsarcosine | Sigma Aldrich | 61743-25G | |
| Hepes | Applichem | A3724,0250 | |
| LiCl | Carl Roth | 3739.2 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I3021-100ml | |
| SDS | Carl Roth | 1833 | |
| Protein G/magnetic beads | Invitrogen | 1004D | |
| 37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-1L | |
| Glycine | |||
| RNase | Peqlab | 12-RA-03 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 46.35 E | |
| Na-butyrate | Sigma Aldrich | SLB2659V | |
| Proteinase inhibitor | Roche | 5892791001 | |
| SYBRgreen Mix | biozym | 617004 | |
| dH2O | Sigma Aldrich | W4502 | |
| 1Kb ladder | Thermofisher | SM1333 | |
| Orange G | Sigma Alrich | 03756-25 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-072 | |
| Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100) | Roth | 3051.4 | |
| DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) | Gibco | 31331-028 | |
| Gel loading tips Multiflex | A.Hartenstein | GS21 | |
| qPCR Plates | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 384 well | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 1.5 mL tubes | Sarstedt | 72,706 | |
| 100-1000µl Filter tips | Sarstedt | 70,762,211 | |
| 2-20µl Filter tips | Sarstedt | 70,760,213 | |
| 2-200µl Filter tips | Sarstedt | 70,760,211 | |
| 0.5-10µl Filter tips | Sarstedt | 701,116,210 | |
| H3K27me3 antibody | Active Motif | 39155 | |
| H3K27ac antibody | Active Motif | 39133 | |
| H3K4me3 antibody | Active Motif | 39159 | |
| H3K4me2 antibody | Active Motif | 39141 | |
| End Repair Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Paramagnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Resuspension buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| A-Tailing Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Ligation Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| RNA Adapter Indexes | Illumina | RS-122-2101 | |
| Stop Ligation Buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| PCR Primer Cocktail | Illumina | FC-121-4001 | |
| Enhanced PCR Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Genomic DNA ladder | Agilent | 5067-5582 | |
| Elution Buffer | Agilent | 19086 | |
| Sample Buffer | Agilent | 5067-5582 | |
| Library Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4835 – 07960204001 | |
| Fertile chicken white eggs | LSL Rhein Main | KN: 15968 | |
| Needle (Neoject) | A.Hartenstein | 10001 | |
| Syringe (Ecoject 10ml) | Dispomed witt oHG | 21010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Hermle | Z 216 MK | |
| Thermoshaker | ITABIS | MKR13 | |
| Sonicator | Active Motive | EpiShear probe sonicator | |
| Sonicator | Diagenode | Bioruptor Plus | |
| Rotator | Stuart | SB3 | |
| Variable volume (5–1,000 μl) pipettes | Eppendorf | N/A | |
| Timer | Sigma | N/A | |
| Magnetic holder | Thermo Fisher | DynaMag-2 12321D | |
| Table spinner | Heathrow Scientific | Sprout | |
| Mixer | LMS | VTX 3000L | |
| Real-Time PCR Cycler | Roche | Light Cycler; Serial Nr.5662 | |
| PCR Cycler | Applied Biosystems | Gene Amp PCR System 9700 | |
| DNA and RNA quality control system | Agilent | Agilent 4200 TapeStation System | |
| Forceps | Dumont | 5-Inox-H | |
| Perforated spoon | World precision instruments | 501997 |
Referenzen
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