الأزرق إيفانز أمثل البروتوكول لتقييم تسرب الأوعية الدموية في الماوس
Summary
ويرد بروتوكولا اقتصادا والأمثل، وبسيطة في هذه المادة، الذي يستخدم الأسلوب صبغة زرقاء إيفانز لتقييم التسرب البلازما في الأجهزة من الفئران ففبن التي يمكن تكييفها للاستخدام في السلالات الأخرى، والأنواع، والأخرى أو الأنسجة.
Abstract
تسرب في الأوعية الدموية، أو التسرب البلازما، يحتوي على عدد من الأسباب، وقد يكون نتيجة خطيرة أو أعراض الاستجابة الالتهابية. هذه الدراسة قد تؤدي في نهاية المطاف إلى المعارف الجديدة بشأن الأسباب أو طرق جديدة لمنع أو علاج التسرب البلازما. من المهم أن الباحثين لها الأدوات المناسبة، بما في ذلك أفضل الطرق المتاحة، لدراسة التسرب البلازما. في هذه المقالة، نحن تصف بروتوكول، استخدام أسلوب صبغة زرقاء إيفانز، من أجل تقييم التسرب البلازما في الأجهزة من الفئران ففبن. هذا البروتوكول بسيط عن عمد، لكبيرة بدرجة ممكن، لكنه يوفر بيانات عالية الجودة. تم اختيار صبغ إيفانز الأزرق أساسا لأنه من السهل للمختبر متوسط لاستخدام. أننا استخدمنا هذا البروتوكول أن تقدم الأدلة وتقديم الدعم للفرضية القائلة بأن نيبريليسين الإنزيم قد تحمي المفرج ضد التسرب البلازما. ومع ذلك، قد تستخدم تجريبيا هذا البروتوكول وتكييفها بسهولة للاستخدام في سلالات أخرى من الفئران أو في الأنواع الأخرى، وفي كثير من الأعضاء أو الأنسجة، مختلف الدراسات التي قد تنطوي على العوامل الأخرى التي تعتبر مهمة في فهم أو منع أو علاج التسرب البلازما. وقد تم تحسين هذا البروتوكول على نطاق واسع وتعديل البروتوكولات القائمة، ويجمع بين الموثوقية، وسهولة الاستخدام، والاقتصاد، والتوافر العام للمواد والمعدات، مما يجعل هذا البروتوكول متفوقة للمختبر متوسط لاستخدامها في تحديد كمية التسرب البلازما من الأجهزة.
Introduction
تسرب الأوعية الدموية في الأجهزة تشير إلى التسرب، أو تسرب لبلازما الدم من خلال الثغرات التي أنتجت في البطانة من وظيفة الأوردة الشعرية في الأجهزة. هذا التسرب البلازما أو زيادة نفاذية الأوعية الدموية، التي قد تنشأ من بعض نوع استجابة التحريضية، قد يؤدي إلى عواقب خطيرة. وبالتالي، فمن المهم أن دراسة هذه الظاهرة وأسبابها، والمغيرون، وعواقبه، ويفهم، وعلى نحو مماثل، أن المحققين لديهم جيدة الأدوات والبروتوكولات الملحقة بها لدراستها. الثغرات غشائي قد تنتج عن طريق عدد من المحفزات، ولكن عادة ما يتم إنتاجها بفعل العصبية الببتيد و/أو تاتشيكينينس على الجهاز. أحد الوسطاء طبيعيا الرئيسية لهذه العملية، مما يؤدي إلى زيادة البلازما التسرب، هو أونديكابيبتيدي تاتشيكينين نيوروبيبتيدي، فماده1.
أساليب التحقيق وقياس نفاذية الأوعية الدموية أو التسرب البلازما، التي تستخدم خاصية الربط الزلال من صبغة زرقاء إيفانز، قد وضعت، وعادة ما تكون معروفة بدقتها، البساطة، والاقتصاد، والسلامة، وقدرة على السماح تحديد التسرب البلازما من أنسجة عدة في وقت واحد، إذا كان الأمر كذلك المطلوب2،3،4،،من56،،من78،9 . هذا البروتوكول إيفانز الأزرق لتقييم التسرب البلازما في الأجهزة من الفئران ففبن يستخدم كل هذه، ولكنها تضيف بعض التعديلات الهامة التي تجعل من عموما مفيدة وقابلة للتكيف للدراسات المستقبلية، التي تشمل المختبر متوسط التي تنظم أو سوف إجراء دراسات هامة من العوامل المرتبطة بالتسرب البلازما أو نفاذية الأوعية الدموية. في هذا البروتوكول، وهو عرض فماده للفئران نمول 1/كغ، التي تقوي التسرب البلازما ب 1.5-fold. وهذا يزيد من الحساسية للبروتوكول، وأسفر عن نتائج قابلة للملاحظة ويمكن الحصول عليها بسهولة أكبر. قد تستخدم العوامل الأخرى التي تؤثر على نفاذية، مثل الببتيدات الأخرى المختلفة، والمواد الكيميائية، أو بعض أشكال الإصابة السامة، أو درس بمختبرات أخرى، كما هو مطلوب. وتستخدم حقن الوريد في هذا البروتوكول ﻹدخال الأزرق إيفانز ومضمون فالنظاميه، الأمر الذي يتطلب جراحة المحطة الطرفية. حبل الوريد الحقن5،،من710، حتى بعد النظر في التقنيات الجراحية اللازمة المحطة الطرفية، غير أسهل السيطرة ويؤدي إلى إنتاج نتائج أكثر اتساقا أكثر من دولة أخرى الحقن الوريدية، بما في ذلك الذيل الوريد الحقن4،9. على الرغم من أنه قد يكون من الممكن إيفانز الأزرق سيدلي به حقن الجيوب الوريدية الرجعية-المداري، لا مراجع في الأدب قد وجد أن استخدام هذا الأسلوب لتسليم الأزرق إيفانز. بيد أما بالنسبة لحقن الوريد الذيل، درجة عالية من الخبرة والممارسة لتكاثر إتقان هذا الأسلوب إلى حد كبير حدود استعماله لنجاح إيفانز الأزرق الحقن. وفي المقابل، أسلوب الحقن بالوريد البديلة كما هو موضح في البروتوكول، ولدينا يقدم حلاً يمكن الحصول عليها من الناحية الفنية. تنفيذ إجراء حاسما لنضح عروق الماوس، فقط بعد التضحية بالماوس perfused الأزرق إيفانز، يزيل صبغ إيفانز الأزرق الزائدة، وقد تم توحيدها في هذا البروتوكول. الأساليب المذكورة سابقا من نضح قد درست بعناية وتعديلها للحصول على الإجراء الحالي. التعديلات الأخرى الموصوفة هنا جميع الأمثل ومباشرة، وغير مكلفة.
هناك بعض القيود الهامة للأسلوب صبغة زرقاء إيفانز. على سبيل المثال، قد تمنع حساسية منخفضة في بعض الأحيان المرتبطة بهذا الأسلوب بعض الفحص الإجمالي المرضية ونسيجية إضافية من الأنسجة من إيفانز الأزرق حقن الحيوانات. ومع ذلك، هذه وغيرها من القيود التي أدت إلى تطوير طرق بديلة والنماذج التي، على الرغم من ذلك، لا تزال تستخدم إيفانز الأزرق. قياس الأزرق إيفانز بالأسفار (بدلاً من مدى البصر) التحليل الطيفي قد تزيد حساسية الأسلوب. بالإضافة إلى ذلك، وضعت الأسفار مجهرية من الأنسجة الملطخة بالأزرق إيفانز للسماح لمراقبة تسرب الأوعية الدموية في مواقع متميزة أكثر11. أيضا، كامل الجسم التصوير والمسح الحيوانات الحية سابقا حقن مع إيفانز الأزرق12 يسمح للتحقيق في تركيزات إيفانز الأزرق بطريقة مستمرة، بدلاً من واحدة خاصة باختيار وقت نقطة من التجربة. ومع ذلك، هذا الأسلوب يتطلب توافر مرافق التصوير المناسبة، وقد تكون مكلفة للغاية. تعديلات تشمل إيفانز الأزرق والمؤداة في نوع في المختبر من النموذج، كما هو الحال في خلية الثقافة أو الفرخ النموذجي تشوريوالانتويك13 (كام) أيضا قد وصف. هذه النماذج تتم مراقبتها بواسطة الأسفار والفحص المجهري إينترافيتال14 ، والسماح للتحديد الكمي للتغييرات نفاذية الأوعية الدموية على مر الزمن، ولكن قد تثير مسائل تتعلق بالنمذجة الدقيقة في فيفو الظروف وقد تكون أيضا باهظة الثمن.
وهناك أساليب أخرى لتحديد وقياس تسرب الأوعية الدموية أو النفاذية، التي لا تنطوي على إدارة إيفانز الأزرق. قد تستخدم هذه الأساليب جزيء فلوري مناسبة (مثل الزلال أو فلوريسسين)، أو جزيء المعلمة نظير مسماة أو خلاف ذلك، الحيوانات الحية (أو إلى الخلية الثقافة أو تشوريوالانتويك (كام) نماذج13، تليها غير الغازية التصوير (المسح الحيوانات الأليفة، التصوير بالرنين المغناطيسي، مجهرية إينترافيتال، ومسح الجسم بأكمله) أو بواسطة الغازية التصوير (مجهر فلوري)3،،من1215. على الرغم من أن هذه التقنيات قد توفر عددا من المزايا أكثر من غيرها إيفانز أساليب الأزرق، لديهم أيضا العيوب، التي قد تتضمن تعقيدات كبيرة، والخبرة المطلوبة، ومواردها، وارتفاع التكاليف النقدية.
نيبريليسين16 (peptidase الإنزيم NEP، المعروف أيضا CD10 أو مدام أو انكيفاليناسي) قد اقترح أن تشارك في منع التسرب البلازما، على الأقل جزئيا، من خلال التمثيل الغذائي الانزيمية والمنظمة الذاتية الجوهر ص وهكذا، في الأنسجة التي يحدث فيها بيبتيداسي الخلية السطحية NEP، قد يكون هناك تخفيف أثر فالجوهر، يفترض بنشاط بيبتيداسي NEP.
في البداية، قمنا باختبار للتسرب الناجم عن فماده البلازما استخدام هذا البروتوكول إيفانز الأزرق المعدلة، مع نوع البرية ففبن (وزن) والفئران (كو) بالضربة القاضية NEP. كان يشتبه في تورط NEP في التسرب المعقم فماده البلازما من هذه الدراسات الأولية، ونحن تصف هذه، وكذلك تجارب دور تشمل NEP في التسرب البلازما. ومع ذلك، التركيز في هذه المخطوطة ليست NEP أو دورها في التسرب البلازما، ولكن بدلاً من التسرب البلازما التجارب نفسها. النتائج NEP هي الممثل لهذا النوع من النتائج التي يمكن الحصول عليها من خلال استخدام هذا البروتوكول المعدل. وقد الأمثل الأسلوب إيفانز الأزرق لقياس التسرب البلازما وتعديلها، كما هو موضح بالتفصيل أدناه للفئران ففبن.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما نوقش أعلاه، دراسة التسرب البلازما قد تؤدي في نهاية المطاف إلى المعارف الجديدة بشأن الأسباب أو طرق جديدة لمنع أو علاج التسرب البلازما. الاستخدام الناجح لبروتوكول التسرب البلازما (أعلاه)، باستخدام صبغة زرقاء إيفانز، قد تجلى في المخطوطة الحالية. على الرغم من أن البيانات أظهرت مرة أخرى ا?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أود أن أشكر أندي بوكزوبوت والدكتور ميكو يشيشينسكي على مساعدتها القيمة والتحرير إلى هذه المخطوطة. تدعمها المنح الواردة من قلب الوطنية والرئة والدم معهد (نهلبي RO1 HL078929، HL014985 اندستريز و RO3 HL095439) وإدارة لشؤون المحاربين القدماء (استعراض الجدارة).
Materials
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
Referenzen
- Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J. Substance P. Eur J Pain. 4 (2), 121-135 (2000).
- Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig skin. Int Arch Allergy Appl Immunol. 91 (3), 232-238 (1990).
- Szabo, A., Menger, M. D., Boros, M. Microvascular and epithelial permeability measurements in laboratory animals. Microsurgery. 26 (1), 50-53 (2006).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Moitra, J., Sammani, S., Garcia, J. G. Re-evaluation of Evans Blue dye as a marker of albumin clearance in murine models of acute lung injury. Transl Res. 150 (4), 253-265 (2007).
- Figini, M., et al. Substance P and bradykinin stimulate plasma extravasation in the mouse gastrointestinal tract and pancreas. Am J Physiol. 272 (4), 785-793 (1997).
- Awad, A. S., et al. Selective sphingosine 1-phosphate 1 receptor activation reduces ischemia-reperfusion injury in mouse kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 290 (6), 1516-1524 (2006).
- Lu, B., et al. The control of microvascular permeability and blood pressure by neutral endopeptidase. Nat Med. 3 (8), 904-907 (1997).
- Gendron, G., Simard, B., Gobeil, F., Sirois, P., D’Orleans-Juste, P., Regoli, D. Human urotensin-II enhances plasma extravasation in specific vascular districts in Wistar rats. Can J Physiol Pharmacol. 82 (1), 16-21 (2004).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Saria, A., Lundberg, J. M. Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues. J Neurosci Methods. 8 (1), 41-49 (1983).
- Fricke, I. B., et al. In vivo bioluminescence imaging of neurogenesis – the role of the blood brain barrier in an experimental model of Parkinson’s disease. Eur J Neurosci. 45 (7), 975-986 (2017).
- Pink, D. B., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery. PLoS One. 7 (3), 33760 (2012).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat Rev Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
- Vandoorne, K., Addadi, Y., Neeman, M. Visualizing vascular permeability and lymphatic drainage using labeled serum albumin. Angiogenesis. 13 (2), 75-85 (2010).
- Turner, A. J., Nalivaeva, N. N. Proteinase dysbalance in pathology: the neprilysin (NEP) and angiotensin-converting enzyme (ACE) families. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52 (4), 40-48 (2006).
- Lu, B., Gerard, N. P., Kolakowski, L. F., Finco, O., Carroll, M. C., Gerard, C. Neutral endopeptidase modulates septic shock. Ann N Y Acad Sci. 780, 156-163 (1996).
- Dempsey, E. C., et al. Neprilysin null mice develop exaggerated pulmonary vascular remodeling in response to chronic hypoxia. Am J Pathol. 174 (3), 782-796 (2009).
- Karoor, V., Oka, M., Walchak, S. J., Hersh, L. B., Miller, Y. E., Dempsey, E. C. Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism. Hypertension. 61 (4), 921-930 (2013).
- Chu, P., Arber, D. A. Paraffin-section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma. Am J Clin Pathol. 113 (3), 374-382 (2000).
- Bircan, S., Candir, O., Kapucuoglu, N., Serel, T. A., Ciris, M., Karahan, N. CD10 expression in urothelial bladder carcinomas: a pilot study. Urol Int. 77 (2), 107-113 (2006).
- Koiso, K., Akaza, H., Ohtani, M., Miyanaga, N., Aoyagi, K. A new tumor marker for bladder cancer. Int J Urol. 1 (1), 33-36 (1994).
- Wick, M. J., et al. Protection against vascular leak in neprilysin transgenic mice with complex overexpression pattern. Transgenic Res. 25 (6), 773-784 (2016).
- Natah, S. S., Srinivasan, S., Pittman, Q., Zhao, Z., Dunn, J. F. Effects of acute hypoxia and hyperthermia on the permeability of the blood-brain barrier in adult rats. J Appl Physiol. 107 (4), 1348-1356 (2009).
- Scholzen, T. E., et al. Neutral endopeptidase terminates substance P-induced inflammation in allergic contact dermatitis. J Immunol. 166 (2), 1285-1291 (2001).
