Un optimisé Evans Blue protocole pour évaluer une fuite vasculaire chez la souris
Summary
Un protocole simple, optimisé et économique décrit dans cet article, qui utilise la méthode du colorant bleu Evans pour évaluer l’extravasation plasmatique dans les organes des souris FVBN qui peuvent être adaptés à d’autres souches, espèces et autres organes ou tissus.
Abstract
Une fuite vasculaire ou l’extravasation plasmatique, a un certain nombre de causes et peut être une conséquence grave ou un symptôme d’une réaction inflammatoire. Cette étude pourrait déboucher sur les nouvelles connaissances concernant les causes du ou des nouveaux moyens d’inhiber ou de traiter l’extravasation plasmatique. Il est important que les chercheurs aient les outils appropriés, y compris les meilleures méthodes disponibles, pour étudier l’extravasation plasmatique. Dans cet article, nous décrivons un protocole, à l’aide de la méthode de colorant bleu Evans, pour évaluer l’extravasation plasmatique dans les organes des souris FVBN. Ce protocole est volontairement simple, à aussi grand un degré possible, mais fournit des données de haute qualité. Bleu Evans a été choisi principalement parce qu’il est facile pour le laboratoire moyen à utiliser. Nous avons utilisé ce protocole pour fournir des preuves et le soutien pour l’hypothèse que l’enzyme néprilysine pourrait protéger les vaisseaux contre l’extravasation plasmatique. Toutefois, ce protocole peut être expérimentalement utilisé et facilement adapté pour être utilisés dans d’autres souches de souris ou chez d’autres espèces, dans de nombreux différents organes ou tissus, pour les études qui peut impliquer des autres facteurs qui sont importants dans la compréhension, la prévention ou le traitement, extravasation plasmatique. Ce protocole a été grandement amélioré et modifiés de protocoles existants et combine fiabilité, facilité d’utilisation, économie et la disponibilité générale des matériaux et équipements, rendant ce protocole supérieur pour le laboratoire moyens à utiliser dans quantifier l’extravasation plasmatique des organes.
Introduction
Une fuite vasculaire dans les organes se réfère à l’extravasation, ou fuite du plasma sanguin par des fentes produites dans l’endothélium des post veinules capillaires dans les organes. Cette extravasation plasmatique ou augmentation de la perméabilité vasculaire, qui peut-être découler d’une réaction inflammatoire quelconque, peut avoir des conséquences graves. Ainsi, il est important que ce phénomène, ses causes, les modulateurs et les conséquences, sont étudiés et compris, et même, que les enquêteurs ont bien des outils et protocoles permettant de les étudier. Les lacunes endothéliales peuvent être produits par un certain nombre de stimuli, mais sont habituellement produites par l’action des neurotransmetteurs peptidiques et/ou tachykinines sur l’endothelia. Un des principaux médiateurs naturels de ce processus, ce qui provoque l’extravasation plasmatique accrue, est l’undecapeptide TACHYKININE neuropeptide, la substance P1.
Méthodes d’enquêter et de mesurer la perméabilité vasculaire ou l’extravasation plasmatique, qui utilisent la propriété de liaison de l’albumine de bleu Evans, ont été développés et sont généralement réputés pour leur précision, simplicité, économie, sécurité et aptitude à permettre le détermination de l’extravasation plasmatique de plusieurs tissus à la fois, dans l’affirmative désiré2,3,4,5,6,7,8,9 . Ce protocole de bleu Evans pour évaluer l’extravasation plasmatique dans les organes des souris FVBN utilise tous ces, mais ajoute quelques modifications importantes qui le rendent généralement utile et adaptable pour de futures études, impliquant le laboratoire moyens qui effectue ou qui seront mener des études importantes des facteurs liés à l’extravasation plasmatique ou perméabilité vasculaire. Dans ce protocole, la substance P est introduite à la souris à 1 nmol/kg, ce qui augmente l’extravasation de plasma par 1,5 fois. Ceci augmente la sensibilité du protocole, ce qui entraîne plus facilement des résultats observables et réalisables. Autres facteurs qui influent sur la perméabilité, telles que diverses autres peptides, produits chimiques ou certaines formes de lésions toxiques, peuvent être utilisés ou étudiés par d’autres laboratoires, comme vous le souhaitez. Veine jugulaire injections sont utilisés dans le présent protocole qui va présenter le bleu Evans et substance P systémique, qui nécessite une chirurgie terminale. Cependant, veine jugulaire injections5,7,10, même après avoir examiné les techniques chirurgicales terminales nécessaires, sont plus faciles à maîtriser et conduire à la production de résultats plus cohérents qu’autre des injections veineuses, y compris la queue de la veine des injections4,9. Bien qu’il serait possible de bleu Evans doivent être fournis par des injections de sinus veineux rétro-orbitaire, aucuns références dans la littérature n’ont été trouvés qui utilisent cette méthode de livraison de bleu Evans. Toutefois, en ce qui concerne les injections de queue de veine, le degré élevé d’expertise et de la pratique de façon reproductible maîtriser cette technique très limite son utilisation pour des injections de bleu Evans réussies. En revanche, la méthode d’injection de rechange veine jugulaire, comme décrit dans notre protocole, offre une solution techniquement possible. Une procédure cruciale pour la perfusion des veines de la souris, effectué juste après le sacrifice de la souris sous perfusion bleu Evans, supprime les excès bleu Evans et a été normalisé par le présent protocole. Méthodes précédemment décrites de perfusion ont été soigneusement examinés et modifiés pour obtenir la procédure actuelle. Autres modifications décrites ici sont tous optimisés, simple et peu coûteux.
Il y a certaines limitations importantes de la méthode de colorant bleu Evans. Par exemple, faible sensibilité, parfois associée à cette méthode peut empêcher certains examen brut supplémentaire de pathologique et histologique des tissus provenant d’animaux d’injection de bleu Evans. Cependant, ceux-ci et autres contraintes ont conduit au développement de méthodes alternatives et des modèles qui, néanmoins, toujours utilisent bleu Evans. La mesure de bleu Evans par fluorescence (plutôt que par la portée visuelle) spectroscopie peut augmenter la sensibilité de la méthode. En outre, la microscopie de fluorescence des tissus de coloration bleu Evans a été développée pour permettre l’observation d’une fuite vasculaire en plus distincts endroits11. Aussi, confiné d’imagerie et d’analyse d’un animal vivant précédemment injecté avec Evans bleu12 permet d’enquête des concentrations de bleu Evans d’une manière continue, plutôt qu’au une propre fois choisi le point de l’expérience. Toutefois, cette méthode requiert la disponibilité d’installations d’imagerie appropriées et peut être très coûteuse. Les adaptations impliquant Evans bleu et interprété dans un type in vitro de modèle, comme dans une cellule culture ou poussin modèle Chorio-13 (CAM) ont également été décrites. Ces modèles sont surveillées par fluorescence et de la microscopie intravitale14 et permettent la quantification des modifications de la perméabilité vasculaire au fil du temps, mais peuvent soulever des questions au sujet de la modélisation précise de in vivo des conditions et peuvent également être cher.
Il y a eu des autres méthodes mises au point afin de déterminer et de quantifier une fuite vasculaire ou perméabilité, qui n’impliquent pas l’administration de bleu Evans. Ces méthodes peuvent employer une molécule fluorescente appropriée (comme l’albumine ou fluorescéine), ou une molécule tagged isotopiquement étiquetée ou autrement, d’animaux vivants (ou à la cellule culture ou Chorio (CAM) modèles13, suivi non invasif imagerie (balayage d’animal de compagnie, MRI, la microscopie intravitale, corps entier balayage) ou invasive d’imagerie (microscopie fluorescente)3,12,15. Bien que ces techniques peuvent offrir un certain nombre d’avantages par rapport aux autres Evans méthodes bleus, ils ont aussi des inconvénients, qui peuvent comprendre leur complexité considérable, compétences requises, les ressources et les coûts monétaires élevés.
Néprilysine16 (la peptidase enzyme NEP, également connu sous le nom CD10, MME ou enképhalinase) a été suggéré d’être impliqués dans l’inhibition de l’extravasation plasmatique, au moins en partie, par le métabolisme enzymatique et l’inactivation de P. de substance endogène Ainsi, dans les tissus où la peptidase de surface cellulaire NEP survient, il peut y avoir une atténuation de l’effet de la substance P, probablement par l’activité peptidase du NEP.
Au départ, nous avons testé pour l’extravasation plasmatique induite par la substance P utilisant ce protocole modifié de bleu Evans, avec FVBN sauvage (WT) et souris knockout (KO) de NEP. Participation de NEP à l’extravasation plasmatique augmentée la substance P a été soupçonnée de ces premières études, et nous décrire ces expériences plus rôle de NEP impliquant dans l’extravasation plasmatique. Toutefois, la mise au point de ce manuscrit n’est pas son rôle dans l’extravasation plasmatique ou NEP, mais plutôt l’extravasation plasmatique expériences eux-mêmes. Les résultats de la NEP sont représentatifs du type de résultats pouvant être obtenus via l’utilisation de ce protocole modifié. La méthode de bleu Evans pour mesurer l’extravasation plasmatique a été optimisée et modifiée, tel que décrit en détail ci-dessous pour les souris FVBN.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comme indiqué ci-dessus, l’étude de l’extravasation plasmatique pourrait déboucher sur les nouvelles connaissances concernant les causes du ou des nouveaux moyens d’inhiber ou de traiter l’extravasation plasmatique. L’utilisation efficace du protocole extravasation plasmatique (ci-dessus), à l’aide de bleu Evans, a été démontrée dans le manuscrit actuel. Bien que les données affichées en arrière l’hypothèse que le NEP peut protéger les vaisseaux contre l’extravasation plasmatique, c’est un …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Andy Poczobutt et Dr Jori Leszczynski pour leur aide précieuse et les modifications à ce manuscrit. Pris en charge par des subventions provenance du National Heart, Lung et Blood Institute (NHLBI RO1 HL078929, HL014985 de PPG et RO3 HL095439) et l’anciens combattants Ministère des (examen du mérite).
Materials
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
Referenzen
- Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J. Substance P. Eur J Pain. 4 (2), 121-135 (2000).
- Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig skin. Int Arch Allergy Appl Immunol. 91 (3), 232-238 (1990).
- Szabo, A., Menger, M. D., Boros, M. Microvascular and epithelial permeability measurements in laboratory animals. Microsurgery. 26 (1), 50-53 (2006).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Moitra, J., Sammani, S., Garcia, J. G. Re-evaluation of Evans Blue dye as a marker of albumin clearance in murine models of acute lung injury. Transl Res. 150 (4), 253-265 (2007).
- Figini, M., et al. Substance P and bradykinin stimulate plasma extravasation in the mouse gastrointestinal tract and pancreas. Am J Physiol. 272 (4), 785-793 (1997).
- Awad, A. S., et al. Selective sphingosine 1-phosphate 1 receptor activation reduces ischemia-reperfusion injury in mouse kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 290 (6), 1516-1524 (2006).
- Lu, B., et al. The control of microvascular permeability and blood pressure by neutral endopeptidase. Nat Med. 3 (8), 904-907 (1997).
- Gendron, G., Simard, B., Gobeil, F., Sirois, P., D’Orleans-Juste, P., Regoli, D. Human urotensin-II enhances plasma extravasation in specific vascular districts in Wistar rats. Can J Physiol Pharmacol. 82 (1), 16-21 (2004).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Saria, A., Lundberg, J. M. Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues. J Neurosci Methods. 8 (1), 41-49 (1983).
- Fricke, I. B., et al. In vivo bioluminescence imaging of neurogenesis – the role of the blood brain barrier in an experimental model of Parkinson’s disease. Eur J Neurosci. 45 (7), 975-986 (2017).
- Pink, D. B., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery. PLoS One. 7 (3), 33760 (2012).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat Rev Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
- Vandoorne, K., Addadi, Y., Neeman, M. Visualizing vascular permeability and lymphatic drainage using labeled serum albumin. Angiogenesis. 13 (2), 75-85 (2010).
- Turner, A. J., Nalivaeva, N. N. Proteinase dysbalance in pathology: the neprilysin (NEP) and angiotensin-converting enzyme (ACE) families. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52 (4), 40-48 (2006).
- Lu, B., Gerard, N. P., Kolakowski, L. F., Finco, O., Carroll, M. C., Gerard, C. Neutral endopeptidase modulates septic shock. Ann N Y Acad Sci. 780, 156-163 (1996).
- Dempsey, E. C., et al. Neprilysin null mice develop exaggerated pulmonary vascular remodeling in response to chronic hypoxia. Am J Pathol. 174 (3), 782-796 (2009).
- Karoor, V., Oka, M., Walchak, S. J., Hersh, L. B., Miller, Y. E., Dempsey, E. C. Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism. Hypertension. 61 (4), 921-930 (2013).
- Chu, P., Arber, D. A. Paraffin-section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma. Am J Clin Pathol. 113 (3), 374-382 (2000).
- Bircan, S., Candir, O., Kapucuoglu, N., Serel, T. A., Ciris, M., Karahan, N. CD10 expression in urothelial bladder carcinomas: a pilot study. Urol Int. 77 (2), 107-113 (2006).
- Koiso, K., Akaza, H., Ohtani, M., Miyanaga, N., Aoyagi, K. A new tumor marker for bladder cancer. Int J Urol. 1 (1), 33-36 (1994).
- Wick, M. J., et al. Protection against vascular leak in neprilysin transgenic mice with complex overexpression pattern. Transgenic Res. 25 (6), 773-784 (2016).
- Natah, S. S., Srinivasan, S., Pittman, Q., Zhao, Z., Dunn, J. F. Effects of acute hypoxia and hyperthermia on the permeability of the blood-brain barrier in adult rats. J Appl Physiol. 107 (4), 1348-1356 (2009).
- Scholzen, T. E., et al. Neutral endopeptidase terminates substance P-induced inflammation in allergic contact dermatitis. J Immunol. 166 (2), 1285-1291 (2001).
