Een geoptimaliseerde Evans Blue Protocol bij het beoordelen van vasculaire lek in de muis
Summary
In dit artikel, is een zuinige, geoptimaliseerde en eenvoudig protocol beschreven die de Evans blauwe kleurstof methode gebruikt voor het beoordelen van de extravasation van het plasma in de organen van FVBN muizen die aangepast voor gebruik in andere stammen, soorten, en andere organen of weefsels worden kunnen.
Abstract
Vasculaire lek, of plasma extravasation, kan heeft een aantal oorzaken, en een ernstig gevolg of symptoom van een ontstekingsreactie. Deze studie kan uiteindelijk leiden tot nieuwe kennis over de oorzaken van of nieuwe manieren om te remmen of plasma extravasation behandelen. Het is belangrijk dat onderzoekers de juiste hulpmiddelen hebben, met inbegrip van de beste methoden beschikbaar, voor de studie van plasma extravasation. In dit artikel beschrijven we een protocol, met behulp van de methode van de blauwe kleurstof Evans, voor de beoordeling van de extravasation van het plasma in de organen van FVBN muizen. Dit protocol is opzettelijk eenvoudig, als groot een diploma als mogelijk, maar biedt hoogwaardige gegevens. Evans blauwe kleurstof heeft uitgekozen, vooral omdat het is gemakkelijk voor de gemiddelde laboratorium te gebruiken. We hebben dit protocol gebruikt om te bewijs en ondersteuning bieden aan de hypothese dat het enzym neprilysin de therapieën tegen plasma extravasation kan beschermen. Echter kan dit protocol worden experimenteel gebruikt en gemakkelijk aangepast voor gebruik in andere muizenstammen of in andere soorten, in vele verschillende organen of weefsels, voor studies die andere factoren die belangrijk zijn bij het begrijpen, te voorkomen of te behandelen kunnen meebrengen Plasma extravasation. Dit protocol is uitgebreid geoptimaliseerd en aangepast ten opzichte van de bestaande protocollen en combineert betrouwbaarheid, gebruiksgemak, economie, en algemene beschikbaarheid van materialen en uitrusting, waardoor dit protocol superieur voor de gemiddelde laboratorium in te gebruiken kwantificeren van plasma extravasation van organen.
Introduction
Vasculaire lek in de organen verwijst naar extravasation, of lekkage van bloedplasma via lacunes geproduceerd in het endotheel van post capillaire venules in de organen. Deze plasma extravasation of toegenomen vasculaire permeabiliteit, die uit een soort van een ontstekingsreactie voortvloeien kan, kan ernstige gevolgen hebben. Het is dus belangrijk dat dit fenomeen, de oorzaken modulatoren en gevolgen, zijn bestudeerd en begrepen, en ook dat onderzoekers goede hebben instrumenten en protocollen om te bestuderen. Het endotheel hiaten via een aantal stimuli kunnen worden geproduceerd, maar meestal worden geproduceerd door de actie van peptide neurotransmitters en/of tachykinins op de endothelia. Een van de grootste natuurlijk voorkomende bemiddelaars van dit proces, wat in verhoogde plasma extravasation resulteert, is de undecapeptide tachykinin neuropeptide substantie P1.
Methoden te onderzoeken en te meten vasculaire permeabiliteit of plasma extravasation, die de albumine-bindende eigenschap van Evans blauwe kleurstof gebruikt, zijn ontwikkeld, en zijn meestal bekend voor hun nauwkeurigheid, eenvoud, economie, veiligheid, en de mogelijkheid om de bepaling van plasma extravasation uit verschillende weefsels tegelijk, als zo gewenst2,3,4,5,6,7,8,9 . Dit protocol Evans blauw voor de beoordeling van de extravasation van het plasma in de organen van FVBN muizen gebruikt al deze, maar voegt enkele belangrijke wijzigingen waarmee u gemakkelijker in het algemeen nuttig en aanpasbaar voor toekomstige studies, waarbij de gemiddelde laboratorium dat voert of zal belangrijk onderzoek van factoren die samenhangen met plasma extravasation of vasculaire permeabiliteit verrichten. In dit protocol, is stof P ingevoerd om de muizen op 1 nmol/kg, die de extravasation van plasma door 1.5-fold verhoogt. Dit verhoogt de gevoeligheid van het protocol, wat resulteert in meer gemakkelijk waarneembare en verkregen resultaten. Andere factoren die van invloed zijn permeabiliteit, zoals verschillende andere peptiden, chemische stoffen of bepaalde vormen van giftige letsel, kunnen worden gebruikt of worden bestudeerd door andere laboratoria, zoals gewenst. Halsslagader injecties worden gebruikt in dit protocol te voeren Evans blauw en stof P systemisch, waarvoor terminal chirurgie. Halsslagader injecties5,7,10, zijn zelfs na bestudering van de nodige terminal chirurgische technieken, echter gemakkelijker te beheersen en leiden tot de productie van meer consistente resultaten dan andere veneuze injecties, met inbegrip van de staart ader injecties4,9. Hoewel het mogelijk voor Evans blauw worden geleverd door de retro-orbitaal veneuze sinus injecties, hebben geen verwijzingen in de literatuur gevonden die gebruik maken van deze methode van levering van Evans blauw. Echter wat staart ader injecties beperkt de hoge graad van expertise en praktijk te reproducibly beheersen deze techniek zeer het gebruik ervan voor succesvolle Evans blauwe injecties. In tegenstelling, biedt de alternatieve halsslagader injectie methode zoals beschreven in ons protocol, een technisch verkrijgbaar oplossing. Een cruciale procedure voor perfusie van de muis van de aderen, uitgevoerd net nadat het offer van de Evans blauw-geperfundeerd muis, verwijdert overtollige Evans blauwe kleurstof en is gestandaardiseerd in dit protocol. Eerder beschreven methoden van perfusie zijn zorgvuldig onderzocht en bewerkt met het oog op de huidige procedure. Andere wijzigingen die hier worden beschreven zijn al geoptimaliseerd, eenvoudig en goedkoop.
Er zijn enkele belangrijke beperkingen van de methode van de blauwe kleurstof Evans. Lage gevoeligheid soms geassocieerd met deze methode kan bijvoorbeeld voorkomen dat met sommige extra bruto pathologische en histologisch onderzoek van weefsels van Evans blauw-geïnjecteerd dieren. Deze en andere beperkingen hebben echter geleid tot de ontwikkeling van alternatieve methoden en modellen, die echter nog steeds gebruik maken van Evans blauw. De meting van Evans blauw door fluorescentie (in plaats van visual-bereik) spectroscopie kan het verhogen van de gevoeligheid van de methode. Bovendien, werd fluorescentie microscopie van Evans blauw gebeitste weefsels ontwikkeld als u wilt toestaan voor de waarneming van vasculaire lek in duidelijker locaties11. Ook hele lichaam imaging en scannen van een levend dier eerder ingespoten met Evans blauw12 voorziet in een onderzoek van Evans blauwe concentraties op een continue wijze, in plaats van op een specifieke tijd gekozen punt van het experiment. Echter, deze methode vereist de beschikbaarheid van adequate beeldvorming faciliteiten, en kan erg duur. Wijzigingen waarbij Evans blauwe en uitgevoerd in een in vitro soort model, zijn zoals in een cel cultuur of kuiken chorion model13 (CAM) ook beschreven. Deze modellen zijn gecontroleerd door fluorescentie en intravital14 microscopie, en toestaan dat de kwantificering van veranderingen van de vasculaire permeabiliteit na verloop van tijd, maar vragen over nauwkeurige modellering van in vivo voorwaarden kunnen verhogen en kunnen ook worden duur.
Zijn er andere methoden ontwikkeld om te bepalen en kwantificeren van vasculaire lekken of permeabiliteit, waarbij niet de administratie van Evans blauw. Deze methoden kunnen tewerkstellen een passende fluorescerende molecuul (zoals albumine of fluoresceïne), of een ionenpaar met een label of anderszins tagged molecule, tot levende dieren (of cel cultuur of chorion (CAM) modellen13, gevolgd door niet-invasieve Imaging (PET-scan, MRI, intravital microscopie, hele lichaam scannen) of door invasieve beeldvormende (fluorescent microscopie)3,12,15. Hoewel deze technieken een aantal voordelen ten opzichte van andere Evans blauwe methoden bieden kunnen, hebben ze ook nadelen, waaronder eventueel hun aanzienlijke complexiteit, vereiste expertise, middelen en hoge monetaire kosten.
Neprilysin16 (de peptidase enzym NEP, ook bekend als CD10, MME of Enkephalinase) heeft gesuggereerd betrokken te worden bij het remmen van plasma extravasation, ten minste gedeeltelijk, door de enzymatische metabolisme en inactivatie van endogene stof P. Dus, in weefsels waarin de cel-oppervlakte peptidase NEP plaatsvindt, kan er een verzwakking van het effect van stof P, vermoedelijk door de peptidase activiteit van NEP.
In eerste instantie, we getest voor stof P-geïnduceerde plasma extravasation met behulp van dit gewijzigde Evans blauw-protocol, met NEP knock-out (KO) muizen en FVBN wild type (WT). NEP betrokkenheid in plasma stof P-augmented extravasation werd verdacht van deze eerste studies, en we beschrijven deze en verdere experimenten waarbij NEP de rol in plasma extravasation. De focus van dit manuscript is niet NEP of haar rol in plasma extravasation, echter liever de plasma extravasation experimenten zelf. De NEP-resultaten zijn representatief voor de aard van de resultaten die kunnen worden verkregen door het gebruik van dit gewijzigde protocol. De blauwe Evans-methode voor het meten van plasma extravasation is geoptimaliseerd en gewijzigd, zoals beschreven in detail hieronder voor FVBN muizen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zoals hierboven is besproken, kan de studie van plasma extravasation uiteindelijk leiden tot nieuwe kennis over de oorzaken van of nieuwe manieren om te remmen of plasma extravasation behandelen. Het succesvolle gebruik van het plasma extravasation protocol (zie hierboven), is met behulp van Evans blauwe kleurstof, aangetoond in het huidige manuscript. Hoewel de gegevens getoond weer aan de hypothese dat NEP de therapieën kan beschermen tegen plasma extravasation, dit is een secundair doel op dit moment met het primaire…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank Andy Poczobutt en Dr. Jori Leszczynski voor hun waardevolle hulp en de wijzigingen in dit manuscript. Ondersteund door subsidies ontvangen van de National Heart, Lung en Blood Institute (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 en RO3 HL095439) en het Department of Veterans’ Affairs (verdienste Review).
Materials
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
Referenzen
- Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J. Substance P. Eur J Pain. 4 (2), 121-135 (2000).
- Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig skin. Int Arch Allergy Appl Immunol. 91 (3), 232-238 (1990).
- Szabo, A., Menger, M. D., Boros, M. Microvascular and epithelial permeability measurements in laboratory animals. Microsurgery. 26 (1), 50-53 (2006).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Moitra, J., Sammani, S., Garcia, J. G. Re-evaluation of Evans Blue dye as a marker of albumin clearance in murine models of acute lung injury. Transl Res. 150 (4), 253-265 (2007).
- Figini, M., et al. Substance P and bradykinin stimulate plasma extravasation in the mouse gastrointestinal tract and pancreas. Am J Physiol. 272 (4), 785-793 (1997).
- Awad, A. S., et al. Selective sphingosine 1-phosphate 1 receptor activation reduces ischemia-reperfusion injury in mouse kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 290 (6), 1516-1524 (2006).
- Lu, B., et al. The control of microvascular permeability and blood pressure by neutral endopeptidase. Nat Med. 3 (8), 904-907 (1997).
- Gendron, G., Simard, B., Gobeil, F., Sirois, P., D’Orleans-Juste, P., Regoli, D. Human urotensin-II enhances plasma extravasation in specific vascular districts in Wistar rats. Can J Physiol Pharmacol. 82 (1), 16-21 (2004).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Saria, A., Lundberg, J. M. Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues. J Neurosci Methods. 8 (1), 41-49 (1983).
- Fricke, I. B., et al. In vivo bioluminescence imaging of neurogenesis – the role of the blood brain barrier in an experimental model of Parkinson’s disease. Eur J Neurosci. 45 (7), 975-986 (2017).
- Pink, D. B., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery. PLoS One. 7 (3), 33760 (2012).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat Rev Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
- Vandoorne, K., Addadi, Y., Neeman, M. Visualizing vascular permeability and lymphatic drainage using labeled serum albumin. Angiogenesis. 13 (2), 75-85 (2010).
- Turner, A. J., Nalivaeva, N. N. Proteinase dysbalance in pathology: the neprilysin (NEP) and angiotensin-converting enzyme (ACE) families. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52 (4), 40-48 (2006).
- Lu, B., Gerard, N. P., Kolakowski, L. F., Finco, O., Carroll, M. C., Gerard, C. Neutral endopeptidase modulates septic shock. Ann N Y Acad Sci. 780, 156-163 (1996).
- Dempsey, E. C., et al. Neprilysin null mice develop exaggerated pulmonary vascular remodeling in response to chronic hypoxia. Am J Pathol. 174 (3), 782-796 (2009).
- Karoor, V., Oka, M., Walchak, S. J., Hersh, L. B., Miller, Y. E., Dempsey, E. C. Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism. Hypertension. 61 (4), 921-930 (2013).
- Chu, P., Arber, D. A. Paraffin-section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma. Am J Clin Pathol. 113 (3), 374-382 (2000).
- Bircan, S., Candir, O., Kapucuoglu, N., Serel, T. A., Ciris, M., Karahan, N. CD10 expression in urothelial bladder carcinomas: a pilot study. Urol Int. 77 (2), 107-113 (2006).
- Koiso, K., Akaza, H., Ohtani, M., Miyanaga, N., Aoyagi, K. A new tumor marker for bladder cancer. Int J Urol. 1 (1), 33-36 (1994).
- Wick, M. J., et al. Protection against vascular leak in neprilysin transgenic mice with complex overexpression pattern. Transgenic Res. 25 (6), 773-784 (2016).
- Natah, S. S., Srinivasan, S., Pittman, Q., Zhao, Z., Dunn, J. F. Effects of acute hypoxia and hyperthermia on the permeability of the blood-brain barrier in adult rats. J Appl Physiol. 107 (4), 1348-1356 (2009).
- Scholzen, T. E., et al. Neutral endopeptidase terminates substance P-induced inflammation in allergic contact dermatitis. J Immunol. 166 (2), 1285-1291 (2001).
