最適化されたエバンス ブルー マウス血管漏出を評価するためにプロトコル
Summary
この記事で経済的、最適化、および単純なプロトコルは、エバンス ブルー色素法を使用して他の株、種と他の臓器や組織での使用に適応することができます FVBN マウスの臓器に血漿漏出を評価するため説明します。
Abstract
血管漏出または血漿漏出の原因の数があり深刻な結果や炎症反応の症状があります。本研究は、原因に関する新しい知識や抑制または血漿漏出を治療する新しい方法に最終的につながる可能性があります。研究者が血漿漏出を勉強するため、利用可能な最善の方法をなど、適切なツールを持つことが重要です。この記事では FVBN マウスの臓器に血漿漏出を評価するためエバンス ブルー色素メソッドを使用して、プロトコルを説明します。このプロトコルは意図的にシンプルに偉大な可能な限り程度が高品質データを提供します。主に使用する平均の所の簡単だ、エバンス ブルー色素を選ばれています。私たちは、酵素ネプリライシンが血漿漏出に対して血管を保護するかもしれないこと仮説の証拠とサポートを提供するためにこのプロトコルを使用しています。ただし、このプロトコルが実験的に使用されマウスの他の系統や他の種の多くの異なる器官またはティッシュの使用研究の理解、予防、または治療に重要な他の要因を伴う可能性がありますに適合しやすい血漿漏出。このプロトコルは広範囲に最適化されているし、既存のプロトコルと組み合わせた信頼性から変更、使いやすさ、経済、そしてこのプロトコルで使用する平均の所の優れたを作る機材の一般の可用性臓器から血漿漏出を定量化します。
Introduction
臓器に血管漏出は、血管外漏出、または血漿の血管内皮細胞で生産の隙間からの漏れは臓器の毛細血管細静脈を投稿します。この血漿漏出、または炎症性応答のいくつかのタイプから生じる、増加の血管透過性重大な結果があります。したがって、この現象、その原因、変調器、および結果は、研究し、理解と同様に、調査官が良い持っているツールやプロトコルが重要ですそれらを勉強します。内皮ギャップ数刺激によって作られるが、通常、ペプチド神経伝達物質タキキニン、内皮細胞上のアクションによって生成されます。Undecapeptide タキキニン神経ペプチド、サブスタンス P1増加血漿漏出の結果、このプロセスの主要な自然発生するメディエーターの一つです。
エバンス ブルー色素のアルブミン結合プロパティを使用して、調査し、血管透過性亢進や血漿漏出を測定する方法が開発されているし、通常その精度、シンプルさ、経済、安全と許可する機能のために知られている、一度に、いくつかの組織から血漿漏出による場合は希望2,3,4,5,6,7,8,9.FVBN マウスの臓器に血漿漏出を評価するためには、このエバンス ブルー プロトコルはこれらのすべてを使用しますが、一般的に役に立つと、又は平均の実験室を含む、将来の研究に適応できるように、いくつかの重要な変更を追加血漿漏出または血管透過性と関連因子の重要な研究を実施します。このプロトコルでは、サブスタンス P が 1 nmol/kg、1.5 倍による血漿の血管外漏出を強化するマウスを紹介します。これはより簡単に観測し、得られる結果の結果、プロトコルの感度を増加します。その他種々 のペプチドを化学物質、毒性傷害のいくつかのフォームなどの透磁率に影響を与えるその他の要因を使用または必要に応じて、その他の研究所で研究します。頚静脈注射は、ターミナルの手術を必要とする全身、エバンス ブルーとサブスタンス P を紹介するこのプロトコルで使用されます。ただし、頚静脈注射5,7,10、必要なターミナル手術手技を考慮した後も易くマスター、他よりもより一貫した結果の生産につながる尾を含む静脈注射、静脈注射4,9。レトロな軌道静脈洞注射によって配信されるブルー ・ エヴァンスのそれは可能ですが、参照文献の見つかっていないこのエバンス ブルーの配信方法を使用します。ただし、尾静脈注射については高度な専門知識と再現性をもって大きくこのテクニックをマスターする練習は成功したエバンス ブルー注射での使用を制限します。対照的に、代替の頚静脈注入法のプロトコルで説明するようソリューションを提供技術的に得られる。マウスの静脈の血流の重要な手順は、エバンス ブルー潅流マウスの犠牲余分なエバンス ブルー色素を削除し、このプロトコルで標準化された直後後に実行されます。灌流の上記の方法は注意深く検討され現在の手順を取得するように変更します。ここで説明したその他の変更はすべて最適化された、簡単で安価です。
エバンス ブルー色素法のいくつかの重要な制限事項があります。たとえば、低感度時このメソッドに関連付けられているは、いくつか追加総病理組織学的および組織学的検討エバンス ブルーを注入した動物からのティッシュを防ぐことができます。ただし、これらやその他の制限は、別の方法と、それにもかかわらず、まだエバンス ブルーを使用するモデルの開発につながっています。エバンス ブルーの測定 (視覚範囲ではなく) 蛍光分光法は方法の感度を高める可能性があります。さらに、複数の別個の場所11血管漏出の観察を許可するエバンス ブルー染色組織の蛍光顕微鏡が開発されました。また、全身イメージングし生きている動物のスキャン以前エバンス ブルー12により継続的に、エバンス ブルーの濃度の調査のための注入ではなく実験の時点で 1 つの特定の時間を選択。ただし、このメソッドは適切なイメージング施設の可用性を必要とする、非常に高価になることがあります。エバンス ブルー、モデルの体外型で行われますを含む変更などセルの文化またはニワトリ漿モデル13 (CAM) も記載されています。これらのモデル蛍光と生体14顕微鏡によって監視されると時間をかけて血管透過性変化の定量化を許可するが、生体内での条件の正確なモデリングに関する質問を上げるかもしれないし、もあります。高価です。
他のメソッドは、エバンス ブルーの管理を伴わない決定し、血管漏出または透過性を定量化するために開発されています。これらのメソッドを使用するかもしれません (アルブミン、フルオレセインなど)、適切な蛍光分子または生きている動物に、同位体標識あるいはタグ分子 (または文化または漿 (CAM) をセルにモデル13、非侵襲的に続いてイメージング (PET スキャン、MRI、生体顕微鏡観察、全身スキャン) または侵襲的イメージング (蛍光顕微鏡)3,12,15。これらの技術は、青いメソッド エヴァンス他上の利点の多数を提供可能性がありますがまた彼らのかなりの複雑さ、必要な専門知識、リソース、および金銭的コストが高いなど欠点があります。
ネプリライシン16 (ペプチダーゼ酵素ネップ、cd 10、MME、またはエンケファリナーゼとして知られている) 酵素代謝や内因性物質 p の不活性化の部分で少なくとも血漿漏出を抑制に関与することが示唆されています。したがって、セル表面ペプチダーゼ ネップが発生した組織でありますネップのペプチダーゼの活動によっておそらくのサブスタンス P の効果の減衰
当初、このエバンス ブルーの修正されたプロトコル FVBN 野生型 (WT) とネップ ノックアウト (KO) マウスを用いたサブスタンス P 誘発される血漿漏出テスト。これらの初期の研究からサブスタンス P 増強血漿漏出にネップの関与が疑われ、これらについて説明を行い, さらに血漿漏出に伴うネップの役割を実験.しかし、本稿の焦点ではないネップまたは血漿漏出におけるその役割、血漿漏出が彼ら自身を実験ではなく。ネップの結果がこの修正されたプロトコルの使用によって得られる結果の種類です。血漿漏出を測定するエバンス ブルー メソッドを最適化されており、FVBN マウスの下に詳細の記載に従って変更します。
Protocol
Representative Results
Discussion
前述したように、血漿漏出に関する研究が最終的の原因に関する新しい知識や抑制または血漿漏出を治療する新しい方法に します。(上記)、血漿の血管外漏出プロトコルの使用の成功は、現在原稿で実証されているエバンス ブルー色素を用いたします。示されているデータもバックアップにネップが血管を保護するかもしれないこと仮説血漿漏出に対してこれは、第二の目的現在、主要目的…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者貴重な支援とこの原稿を編集アンディ Poczobutt、博士 Jori Leszczynski を感謝したいです。 国立心臓、肺および血の協会 (NHLBI RO1 HL078929、PPG HL014985 と RO3 HL095439) 退役軍人省問題 (メリット レビュー) から受け取った補助金によってサポートされています。
Materials
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
Referenzen
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