تصنيع المصفوفة خارج الخلية اللسان وإعادة تشكيل للسان الخلايا الحرشفية في المختبر
Summary
أسلوب يظهر هنا لإعداد المصفوفة خارج الخلية اللسان (TEM) مع ديسيلولاريزيشن تتسم بالكفاءة. يمكن استخدام في تيم السقالات الوظيفية لإعادة بناء نموذج الخلايا الحرشفية (TSCC) اللسان تحت ظروف ثقافة ثابتة أو المقلبة.
Abstract
من أجل بناء نموذج فعال وواقعي للسان صدفية خلية سرطان (TSCC) في المختبر، تم إنشاؤها بأساليب لإنتاج ديسيلولاريزيد اللسان خارج الخلية مصفوفة (TEM) الذي يوفر السقالات الوظيفية للبناء TSCC. تيم تنص مكانة في المختبر لنمو الخلايا، والتمايز، والهجرة الخلية. المجهرية من المصفوفة خارج الخلية الأصلية (ECM) والتراكيب الكيميائية الحيوية الإبقاء في المصفوفة على ديسيلولاريزيد توفير منافذ خاصة بالانسجة لترسيخ الخلايا. يمكن أن تتحقق تلفيق تيم بالهضم ديوكسيريبونوكليسي (الدناز) مصحوبا جدية للمعالجة العضوية أو غير العضوية. من السهل أن تعمل هذا البروتوكول ويضمن كفاءة عالية ديسيلولاريزيشن. وأظهرت تيم سيتوكومباتيبيليتي مواتية للخلايا TSCC ظروف ثقافة ثابتة أو المقلبة، التي تمكن من بناء نموذج TSCC. كما استخدمت مفاعل حيوي عصامي للشرط المقلبة المستمرة لثقافة الخلية. وأظهرت TSCC أعيد بناؤها باستخدام ال سمات وخصائص تشبه السريرية TSCC الأنسجة، مما يوحي بإمكانية البحث TSCC.
Introduction
وقد اللسان مختلف المهام الهامة، مثل ديجلوتيشن، وصياغة، وتذوق. وهكذا، الأضرار بوظيفة اللسان تأثيراً كبيرا على نوعية حياة المرضى1. هو الورم الخبيث الأكثر شيوعاً في تجويف الفم اللسان الخلايا الحرشفية (TSCC)، التي تحدث عادة في الأشخاص الذين يشربون الكحول أو دخان التبغ2.
في السنوات الأخيرة، تم إحراز تقدم ضئيل في البحوث الأساسية في TSCC. الافتقار إلى الكفاءة في المختبر البحث نماذج يظل واحداً من أكبر المشاكل. وهكذا، تبين المصفوفة خارج الخلية (ECM) أن يكون حل محتمل. نظراً لإدارة المحتوى في المؤسسة إطار شبكة معقدة تتألف من عناصر المصفوفة درجة عالية من التنظيم، ستكون المواد سقالة بعد إدارة المحتوى في المؤسسة مثل هيكل وتكوين المختصة لبحوث السرطان. يمكن أن توفر إدارة المحتوى في المؤسسة ديسيلولاريزيد تماما المكانة للخلايا من نفس المنشأ في المختبر، الذي تبين أن أهم ميزة إدارة المحتوى في المؤسسة.
يمكن الاحتفاظ بالمحتوى مع المكونات الخلوية تجري إزالته من الأنسجة من خلال ديسيلولاريزيشن استخدام المنظفات والأنزيمات. توفر مختلف عناصر إدارة المحتوى في المؤسسة، بما في ذلك الكولاجين وفيبرونيكتين laminin في مصفوفة ديسيلولاريزيد المكروية أصلي-الأنسجة-مثل للخلايا المستزرعة، والتشجيع على البقاء والانتشار، وتمايز الخلايا3. وعلاوة على ذلك، يمكن تقليل الاستمناع لزرع الأعضاء إلى الحد أدنى مع عدم وجود المكونات الخلوية في إدارة المحتوى في المؤسسة.
حتى الآن، وقد حاولت اختﻻق أساليب لإدارة المحتوى في المؤسسة ديسيلولاريزيد في مختلف الأنسجة والأعضاء، مثل قلب4،5،،من67، الكبد8،9،10 ،11، الرئة12،13،،من1415،،من1617و18،الكلي19 , 20-ومع ذلك، قد وجدت لا البحوث ذات الصلة على القيام بأعمال مماثلة في اللسان لأفضل معرفتنا.
في هذه الدراسة، كانت ملفقة اللسان ديسيلولاريزيد المصفوفة خارج الخلية (TEM) كل كفاءة وبأسعار زهيدة بسلسلة من المعالجة الفيزيائية والكيميائية والانزيميه. ثم استخدمت في تيم للخص TSCC في المختبر، عرض محاكاة مناسبة للسلوك TSCC والتنمية. وقد تيم حسن توافق مع الحياة، فضلا عن القدرة على توجيه الخلايا المتخصصة الخاصة بالانسجة، مما يشير إلى أن تيم قد إمكانات كبيرة في TSCC البحث3. البروتوكول هو موضح هنا يوفر خياراً للباحثين الذين يدرسون في نشوء المرض أو العلاجات السريرية في TSCC.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول راسخة لتلفيق ECM ديسيلولاريزيد ينبغي الاحتفاظ بتكوين إدارة المحتوى في المؤسسة الأصلية أثناء إزالة المكونات الخلوية في الأنسجة تقريبا تماما21. وعلى الرغم من ديسيلولاريزيشن المبلغ عنها حاليا البروتوكولات التي تتطلب نضح عن طريق المفرج إزالة المواد الخلوية عن طريق النق…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب تقر بالدعم للمنح البحثية من مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية الوطنية (31371390)، وبرنامج مشروع تنمية التكنولوجيا العالية الدولة (2014AA020702) والبرنامج “قوانغدونغ العلوم” والتكنولوجيا (2016B030231001).
Materials
| C57-BL/6J mice | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-2.5L | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 | |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Dibasic Sodium Phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| 1.5 mL EP tube | Axygen | MCT-150-A | |
| Ultra-low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 3.5 cm cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | V900502 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 449164 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Magnesium sulphate | Sangon Biotech | A601988 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| Surgical suture | Shanghai Jinhuan | ||
| 250 mL wide-mouth bottle | SHUNIU | 1407 | |
| Magnetic stirrer | AS ONE | 1-4602-32 | |
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| 10 mL syringe | Hunan Pingan | ||
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| Cal27 cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Tongue squamous cell carcinoma cell line | |
| U2OS cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Hepes free acid | BBI | A600264 | |
| FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| 4 °C fridge | Haier | ||
| Water purifier | ELGA | ||
| Hemocytometer | BLAU | 717805 |
Referenzen
- Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer. J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).
- Patel, S. C., et al. Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women, Age 18 to 44 Years. J. Clin. Oncol. 29, 1488-1494 (2011).
- Zhao, L., Huang, L., Yu, S., Zheng, J., Wang, H., Zhang, Y. Decellularized tongue tissue as an in vitro. model for studying tongue cancer and tongue regeneration. Acta Biomaterialia. 58, 122-135 (2017).
- Ng, S. L., Narayanan, K., Gao, S., Wan, A. C. Lineage restricted progenitors for the repopulation of decellularized heart. Biomaterials. 32, 7571-7580 (2011).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
- Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. J. Vis. Exp. (6), e50059 (2012).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C-ME. 16, 525-532 (2010).
- Baptista, P. M., Siddiqui, M. M., Lozier, G., Rodriguez, S. R., Atala, A., Soker, S. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
- Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 677-686 (2011).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).
- Bonvillain, R. W., et al. A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 2437-2452 (2012).
- Daly, A. B., et al. Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 1-16 (2012).
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Pt A. 16, 2581-2591 (2010).
- Wallis, J. M., et al. Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung de-cellularization and re-cellularization. Tissue Eng. Part C-ME. 18, 420-432 (2012).
- Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
- Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat. Med. 19, 646-651 (2013).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Song, J. J., Ott, H. C. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds. Trends Mol. Med. 17, 424-432 (2011).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Shamis, Y., et al. Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).
