Fabricación de la matriz extracelular de la lengua y reconstitución de células escamosas de lengua In Vitro
Summary
Aquí se muestra un método para la preparación de la matriz extracelular de la lengua (TEM) con descelularización eficiente. La temperatura puede utilizarse como andamios funcionales para la reconstrucción de un modelo de carcinoma de células escamosas (TSCC) lengua bajo condiciones de cultivo estático o agitada.
Abstract
Con el fin de construir un modelo eficaz y realista para lengua squamous cell carcinoma (TSCC) en vitro, los métodos fueron creados para producir decellularized lengua matriz extracelular (TEM) que proporciona funciones andamios para la construcción de TSCC. TEM proporciona un nicho en vitro para el crecimiento celular, diferenciación y migración celular. Las microestructuras de nativo matriz extracelular (ECM) y composiciones bioquímicas retenidos en la matriz de decellularized proporcionan nichos de tejidos específicos para el anclaje de las células. La fabricación de TEM puede ser realizada por digestión de desoxirribonucleasa (DNasa) acompañada de una seria de tratamiento orgánico o inorgánico. Este protocolo es fácil de operar y asegura alta eficiencia para la descelularización. El TEM demostró cytocompatibility favorable para las células TSCC bajo condiciones de cultivo estático o agitada, que permite la construcción del modelo TSCC. Un biorreactor hecho a sí mismo también fue utilizado para la persistente condición agitada para el cultivo celular. TSCC reconstruido usando TEM demostraron las características y propiedades que se asemejan a la histopatología clínica de TSCC, sugiriendo el potencial en investigación TSCC.
Introduction
La lengua tiene varias funciones importantes, tales como deglución, articulación y degustación. Así, el deterioro de la función de la lengua tiene gran impacto en la calidad de vida de pacientes1. La neoplasia más frecuente en la cavidad bucal es lengüeta carcinoma de célula squamous (TSCC), que generalmente ocurre en personas que beben alcohol o fuman tabaco2.
En los últimos años, se ha logrado poco progreso en la investigación fundamental de TSCC. La falta de investigación eficiente en vitro modelos restos para ser uno de los mayores problemas. Por lo tanto, la matriz extracelular (ECM) resulta para ser una solución potencial. Desde ECM es una estructura de red compleja compuesta por componentes de la matriz altamente organizados, materiales del andamio con un ECM-como la estructura y composición sería competentes para la investigación del cáncer. ECM decellularized perfectamente puede proporcionar el nicho de las células desde el mismo origen en vitro, que resulta para ser la más importante ventaja de ECM.
ECM puede conservarse con componentes celulares de los tejidos a través de la descelularización mediante detergentes y enzimas. Varios componentes de la ECM, incluyendo colágeno, fibronectina y laminina en la matriz de decellularized proporcionan un microambiente natural-tejido-como de células cultivadas, promover la supervivencia, proliferación y diferenciación de las células3. Además, la inmunogenicidad para el trasplante se puede reducir a un mínimo con la ausencia de componentes celulares en ECM.
Hasta ahora, métodos de fabricación para ECM decellularized se han ensayado en diferentes tejidos y órganos, como corazón4,5,6,7, hígado8,9,10 ,11, pulmón12,13,14,15,16,17y18,de riñón19 , 20. sin embargo, se ha encontrado ninguna investigación relevante en trabajos similares en la lengua al mejor de nuestro conocimiento.
En este estudio, matriz extracelular de la lengua decellularized (TEM) se fabricó eficientemente y barato por una serie de tratamiento físico, químico y enzimático. Entonces la temperatura solía recapitular TSCC en vitro, mostrando una simulación adecuada para el desarrollo y comportamiento TSCC. TEM tiene buena biocompatibilidad, así como la capacidad de guiar a las células hacia el nicho de tejidos específicos, que indica que TEM puede tener gran potencial en TSCC investigación3. El protocolo que se muestra a continuación proporciona una opción para investigadores estudiando en patogenesia o terapias clínicas de TSCC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un protocolo bien establecido para la fabricación de ECM decellularized debe conservar la composición nativa de ECM al eliminar componentes celulares en los tejidos casi totalmente21. A pesar de los protocolos actualmente divulgado de la descelularización que requieren de la perfusión a través de la vasculatura para quitar materiales celulares por transporte convectivo, agitación mecánica fue adoptada aquí, conocido como un método sencillo y barato tradicional22 <s…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen el apoyo de becas de investigación de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (31371390), el programa del proyecto de desarrollo estatal de alta tecnología (2014AA020702) y el programa de Guangdong ciencia y tecnología (2016B030231001).
Materials
| C57-BL/6J mice | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-2.5L | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 | |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Dibasic Sodium Phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| 1.5 mL EP tube | Axygen | MCT-150-A | |
| Ultra-low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 3.5 cm cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | V900502 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 449164 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Magnesium sulphate | Sangon Biotech | A601988 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| Surgical suture | Shanghai Jinhuan | ||
| 250 mL wide-mouth bottle | SHUNIU | 1407 | |
| Magnetic stirrer | AS ONE | 1-4602-32 | |
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| 10 mL syringe | Hunan Pingan | ||
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| Cal27 cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Tongue squamous cell carcinoma cell line | |
| U2OS cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Hepes free acid | BBI | A600264 | |
| FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| 4 °C fridge | Haier | ||
| Water purifier | ELGA | ||
| Hemocytometer | BLAU | 717805 |
Referenzen
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