Fabricação de língua matriz extracelular e reconstituição da língua Carcinoma de células escamosas In Vitro
Summary
Um método é mostrado aqui para a preparação da matriz extracelular de língua (TEM) com decellularization eficiente. A temperatura pode ser usada como andaimes funcionais para a reconstrução de um modelo de carcinoma de células escamosas (TSCC) língua sob as condições de cultura estático ou mexido.
Abstract
A fim de construir um modelo eficaz e realista para língua escamosas carcinoma (TSCC) em vitro, os métodos foram criados para produzir decellularized língua matriz extracelular (TEM) que fornece andaimes funcionais para construção de TSCC. TEM fornece um nicho em vitro para crescimento celular, diferenciação e migração celular. As microestruturas de nativo da matriz extracelular (ECM) e composições bioquímicas retidas na matriz decellularized fornecem nichos de tecido-específica para ancoragem de células. Fabricação de temperatura pode ser realizada por digestão desoxirribonuclease (DNase), acompanhada de uma séria de pré-tratamento orgânico ou inorgânico. Este protocolo é fácil de operar e garante alta eficiência para o decellularization. A temperatura mostrou favorável cytocompatibility para células TSCC sob condições de cultura estático ou mexido, que permite a construção do modelo de TSCC. Um biorreator self-made também foi utilizado para a condição de mexido persistente para cultura de células. TSCC reconstruída usando TEM mostrou as características e propriedades, assemelhando-se a clínica histopatologia TSCC, sugerindo o potencial em investigação TSCC.
Introduction
A língua tem várias funções importantes, tais como deglutição, articulação e degustação. Assim, o comprometimento da função da língua tem grande impacto na qualidade de vida de1 pacientes. A malignidade mais comum na cavidade oral é a língua carcinoma de células escamosas (TSCC), que normalmente ocorre em pessoas que bebem álcool ou fumam tabaco2.
Nos últimos anos, pouco progresso foi alcançado na investigação fundamental na TSCC. A falta de investigação eficiente em vitro modelos permanece para ser um dos maiores problemas. Assim, a matriz extracelular (ECM) acaba por ser uma solução em potencial. ECM é um quadro de rede complexo composto de componentes de matriz altamente organizada, tendo um ECM-como a estrutura e a composição de materiais de andaime seria competentes para pesquisa do câncer. Decellularized ECM perfeitamente pode fornecer o nicho de células de mesma origem em vitro, que acaba por ser a mais significativa vantagem de ECM.
ECM pode ser mantido com componentes celulares, sendo retirados os tecidos através da decellularization, usando detergentes e enzimas. Vários componentes de ECM, incluindo colágeno, fibronectina e laminina na matriz decellularized fornecem um microambiente nativo-tecido-como para culturas de células, promovendo a sobrevivência, proliferação e diferenciação das células3. Além disso, a imunogenicidade para transplante pode ser reduzida a um nível mínimo, com a ausência de componentes celulares em ECM.
Até agora, os métodos de fabricação para ECM decellularized têm sido tentados em diferentes tecidos e órgãos, como coração4,5,6,7, fígado8,9,10 ,11, pulmão12,13,14,15,16,17e18,de rim19 , 20. no entanto, nenhuma pesquisa relevante tem ser encontrado em trabalho semelhante na língua com o melhor de nosso conhecimento.
Neste estudo, matriz extracelular de língua decellularized (TEM) foi fabricada tanto de forma eficiente e barata por uma série de tratamento físico, químico e enzimático. A temperatura foi usada para recapitulate TSCC em vitro, mostrando uma simulação apropriada para o desenvolvimento e comportamento TSCC. TEM tem boa biocompatibilidade, bem como a capacidade de guiar as células para o nicho de tecido-específica, que indica que TEM pode ter grande potencial em TSCC pesquisa3. O protocolo mostrado aqui fornece uma escolha para pesquisadores estudando na patogênese ou terapias clínicas de TSCC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um protocolo bem estabelecido para a fabricação de ECM decellularized deve manter a composição de ECM nativa ao remover componentes celulares nos tecidos quase completamente21. Apesar de protocolos decellularization atualmente relatado que exigem perfusão através de vasculatura para remover materiais celulares por transporte convectivo, agitação mecânica foi adotada aqui, conhecido como um método simples e barato tradicional22 , 23</su…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o apoio de bolsas de investigação da Fundação Nacional de ciências naturais da China (31371390), o programa de projeto de desenvolvimento de alta tecnologia do estado (2014AA020702) e o programa de Guangdong de ciência e tecnologia (2016B030231001).
Materials
| C57-BL/6J mice | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-2.5L | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 | |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Dibasic Sodium Phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| 1.5 mL EP tube | Axygen | MCT-150-A | |
| Ultra-low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 3.5 cm cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | V900502 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 449164 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Magnesium sulphate | Sangon Biotech | A601988 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| Surgical suture | Shanghai Jinhuan | ||
| 250 mL wide-mouth bottle | SHUNIU | 1407 | |
| Magnetic stirrer | AS ONE | 1-4602-32 | |
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| 10 mL syringe | Hunan Pingan | ||
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| Cal27 cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Tongue squamous cell carcinoma cell line | |
| U2OS cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Hepes free acid | BBI | A600264 | |
| FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| 4 °C fridge | Haier | ||
| Water purifier | ELGA | ||
| Hemocytometer | BLAU | 717805 |
Referenzen
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