Een proximale cultuur methode om te studeren Paracrine signalen tussen cellen
Summary
Paracrine en juxtacrine cellulaire interacties spelen een belangrijke rol in vele biologische processen, met inbegrip van de progressie van de tumor, immuunresponsen, angiogenese en ontwikkeling. Hier, wordt een proximale cultuur-methode gebruikt om te studeren paracrine signalering waar de gelokaliseerde concentraties van de secreted factoren terwijl het voorkomen van rechtstreekse cellulaire contacten worden onderhouden.
Abstract
Intercellulaire interacties spelen een belangrijke rol in vele biologische processen, met inbegrip van de progressie van de tumor, immuunresponsen, angiogenese en ontwikkeling. Paracrine of juxtacrine signalering bemiddelt dergelijke interacties. Het gebruik van een geconditioneerde medium en coculture studies zijn de meest voorkomende methoden te discrimineren tussen deze twee soorten interacties. Echter het effect van gelokaliseerde hoge concentraties van secreted factoren in de communicatie tijdens de paracrine interactie is niet nauwkeurig gerecapituleerd door geconditioneerde medium en, dus, kan leiden tot onnauwkeurige conclusies. Om dit probleem te verhelpen, hebben we een proximale cultuur methode om te studeren paracrine signalering bedacht. De twee celtypes worden gekweekt op een oppervlak van een 10 µm dik polycarbonaat membraan met 0.4 µm poriën. De poriën kunnen de uitwisseling van secreted factoren en, tegelijkertijd, remmen juxtacrine signalering. De cellen kunnen worden verzameld en aan het eindpunt om de effecten van de paracrine signalering lysed. Deze methode is naast voor gelokaliseerde concentratie gradiënten van secreted factoren, vatbaar voor experimenten met langere periodes van cultuur, alsmede het gebruik van remmers. Terwijl wij deze methode gebruiken om te studeren van de interacties tussen ovariale kankercellen en de mesothelial cellen die ze op de site van metastase tegenkomen, kan het worden aangepast aan elke twee aanhangend celtypes voor onderzoekers te bestuderen paracrine signalering in verschillende gebieden, inclusief tumor communicatie, immunologie en ontwikkeling.
Introduction
De rol van productieve wederzijdse interactie tussen kankercellen en de communicatie van de tumor in de tumor progressie is goed opgezet en is uitgegroeid tot een belangrijk aandachtspunt voor onderzoek naar kanker biologie1. Soortgelijke gevallen van bidirectionele signalering zijn van cruciaal belang tijdens wond genezing, immuunresponsen, angiogenese, stamcel niches, en tijdens ontwikkeling2,3,4,5,6 , 7 , 8. een gemeenschappelijk thema in al deze biologische processen is dat de cellen reageren op verschillende manieren te extracellulaire signalen van hun communicatie die bepalen het lot van de cel, weefsel fysiologie en progressie van de ziekte. Daarom heeft de focus steeds gedraaid naar het ontwikkelen van een beter inzicht in de mechanismen die betrokken zijn bij dergelijke cel-cel communicatie. Een meerderheid van dergelijke interacties betrekken paracrine of juxtacrine signalen tussen cellen. Paracrine signalering impliceert de secretie van specifieke signalering factoren met één cel die worden waargenomen door de bijbehorende receptoren op een andere cel in de nabijheid, triggering van een reactie in het9,10, overwegende dat juxtacrine signalering vereist rechtstreeks contact tussen cellulaire componenten van de twee cellen betrokken11,12.
Dergelijke signalering is een essentieel onderdeel in de weefsel homeostase, evenals in de communicatie van de tumor. De kankercellen profiteren van paracrine en juxtacrine factoren van cellen in het stroma tumor, met inbegrip van kanker-geassocieerde fibroblasten (IGFA), immune cellen en adipocytes13,14,15,16. De paracrine signalering kan worden bemiddeld door groeifactoren cytokines, chemokines, enz., terwijl de juxtacrine signalering omvat naast elkaar geplaatste liganden en receptoren zoals in Notch signalering, of interacties tussen integrins en hun respectieve extracellulaire matrix eiwitten. We hebben aangetoond dat het belang van wederzijdse interactie tussen ovariale kankercellen en IGFA in tumor progressie en metastase14. Ook reguleren de interacties van metastaserende ovariale kankercellen met de mesothelial cellen die betrekking hebben op de site van metastase belangrijke microRNAs en transcriptiefactoren in de kankercellen die bevordering van metastatische kolonisatie17, 18.
De meeste studies over paracrine signalering betrekking hebben op het gebruik van een geconditioneerde medium verzameld uit één celtype voor de behandeling van de tweede celtype met. Terwijl deze aanpak wijd verbeid gebruikt is, het niet efficiënt gerepliceerd de gelokaliseerde high-concentratieniveaus van de secreted factor in de communicatie van de ontvangende cel. Ook er niet in slaagt te reproduceren de kinetiek van de continue stroom van de secreted factor wordt geproduceerd door één cel en ontvangen door de naburige cel. Paracrine signalering is effectief over korte afstanden, zoals de secreted factoren bij de vereiste concentraties alleen in de nabijheid van de broncel zijn en zijn meestal diffuus en Verdun uit als de afstand toeneemt. Deze gelokaliseerde hoge concentratie van de secreted factor is essentieel om te leiden tot een reactie in de cel receptor. Bovendien is de reactie in de ontvangende cellen ook afhankelijk van de balans tussen nieuw secreted factoren en hun continue uitputting door afbraak, binding en toerekening in de ontvangende cellen en de verspreiding van de broncel. Geconditioneerde medium kan worden geconcentreerd op de hogere gelokaliseerde concentraties aanwezig in de communicatie voor hun rekening, maar die niet nauwkeurig de exacte concentratie te repliceren. Bovendien, het kan niet bootsen de natuurlijke kinetiek van productie en uitputting van de factor betrokken. Om nauwkeuriger repliceren paracrine signalering en scheiden van juxtacrine signalering mechanismen, hebben we een nieuwe proximale cultuur-methode, waarbij de twee celtypes op beide oppervlak van een poreuze membraan groeiende bedacht. De poriën zijn klein genoeg om te voorkomen dat juxtacrine interacties en toch toe de uitwisseling van secreted factoren bij gelokaliseerde hoge concentraties. Op die manier behoudt dit systeem de kinetiek van de productie en de uitputting van de paracrine factoren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inzicht van het mechanisme van paracrine en juxtacrine signalen tussen cellen is essentieel voor de ontwikkeling van een betere kennis van de normale weefsel homeostase en ziekte voorwaarden7,8. De meeste paracrine signalering onderzoeken worden uitgevoerd door het verzamelen van geconditioneerd medium uit één celtype en het gebruik ervan voor de behandeling van het andere celtype. Deze methode heeft een voordeel in zijn inherente eenvoud. Echter, het is niet n…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dank verschuldigd aan de patiënten voor hun deelname aan de collectie van het weefsel voor deze experimenten. Dit onderzoek wordt ondersteund door een DoD OCRP ovariële kanker Academy Award (W81XWH-15-0253) en een pilot van Colleen de Dream Foundation naar Anirban K. Mitra.
Materials
| 24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert | Corning (Costar) | 3412 | • 10 µm thick translucent polycarbonate membrane • Treated for optimal cell attachment • Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case • Membrane must be stained for cell visibility • Sterilized by gamma radiation |
| 6 well plate | Corning (Falcon) | 353046 | Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid |
| 15 cm culture dish | Corning (Falcon) | 353025 | Sterile, TC-treated Cell Culture Dish |
| DMEM | Corning (Cellgro) | 10-013-CV | |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning (Cellgro) | 25-025-CI | |
| MEM Vitamins | Corning (Cellgro) | 25-020-CI | |
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Pipets | Any make is fine | ||
| CO2 Incubator | Any make is fine | ||
| Biosafety level II cabinet | Any make is fine | ||
| FN1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01549976_m1 | |
| TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs00998133_m1 | |
| CDH1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01023895_m1 | |
| GAPDH TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs99999905_m1 | |
| miRNeasy mini RNA isolation Kit | Qiagen | 217004 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 43-688-13 | |
| HeyA8 ovarian cancer cells | Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago | ||
| TGFβ Neutralizing Antibody | R&D Systems | MAB1835-100 |
Referenzen
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Cupedo, T., Mebius, R. E. Cellular interactions in lymph node development. The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).
- Suvas, S. Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis. The Journal of Immunology. 199 (5), 1543-1552 (2017).
- Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair. Methods in Molecular Biology. , 123-146 (2016).
- Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure. Heart Failure Reviews. 15 (6), 531-542 (2010).
- Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells – what challenges do they pose. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (7), 497-512 (2014).
- Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).
- Elenbaas, B., Weinberg, R. A. Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation. Experimental Cell Research. 264 (1), 169-184 (2001).
- Wilson, K. J., et al. EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling. Growth Factors. 30 (2), 107-116 (2012).
- Kopan, R. Notch signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).
- Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype. Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 32890-32901 (2007).
- Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Krebsforschung. 72 (10), 2473-2480 (2012).
- Mitra, A. K., et al. MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer. Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).
- Salimian Rizi, B., et al. Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells. Krebsforschung. 75 (2), 456-471 (2015).
- Mitra, A. K., et al. Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis. Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).
- Tomar, S., et al. ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase. Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).
- Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis Available from: https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination (2016)
- Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).
- Boelens, M. C., et al. Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways. Cell. 159 (3), 499-513 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
- Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment. Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).
