Проксимальный культуры метод для изучения паракринными сигнализации между ячейками
Summary
Паракринными и juxtacrine клеточных взаимодействия играют важную роль во многих биологических процессах, включая прогрессии опухоли, иммунные реакции, ангиогенез и развития. Здесь метод проксимального отдела культуры используется для изучения паракринными сигнализации, где поддерживается локализованные концентрации факторов выделяется допуская прямого контакта клеточных.
Abstract
Межклеточных взаимодействий играют важную роль во многих биологических процессах, включая прогрессии опухоли, иммунные реакции, ангиогенез и развития. Паракринными или juxtacrine сигнализации опосредует такого взаимодействия. Использование условных среднего и coculture исследования являются наиболее распространенными методами для выявления различий между этими двумя типами взаимодействий. Однако эффект локализованные высокие концентрации факторов выделяется в микроокружения во время взаимодействия паракринными точно не изъятый с кондиционерами средой и, таким образом, может привести к неточным выводам. Чтобы преодолеть эту проблему, мы разработали метод проксимального отдела культуры для изучения паракринными сигнализации. Типы клеток двух выращиваются на любой поверхности 10 мкм толстые поликарбонатные мембраны с порами 0,4 мкм. Поры позволяют обмена выделяется факторов и, в то же время, препятствует juxtacrine сигнализации. Клетки могут быть собраны и анализироваться в конечной точке для определения последствий паракринными сигнализации. Помимо возможности для локализованных градиенты концентрации секретируемые факторов, этот метод является поддаются эксперименты с длительной культуры, а также использование ингибиторов. Хотя мы используем этот метод для изучения взаимодействия между клетки рака яичников и мезотелиальной клетки, которыми они сталкиваются на сайте метастазов, она может быть адаптирована для любых двух типов адэрентных клеток для исследователей для изучения паракринными сигналов в различных областях, включая микроокружения опухоли, иммунологии и развития.
Introduction
Роль продуктивных взаимные взаимодействий между раковые клетки и микроокружения опухоли в прогрессии опухоли хорошо создан и стал одним из основных направлений исследований в биологии рака1. Подобные случаи двунаправленный сигнализации важны во время заживления, иммунные реакции, ангиогенез, ниши стволовых клеток и развития2,3,4,5,6 , 7 , 8. общей темой во всех этих биологических процессах является, что клетки реагируют в различных способов внеклеточные сигналы от их микроокружения которые определяют судьбу клеток, тканей физиологии и прогрессирования заболевания. Таким образом основное внимание чаще превратилась в сторону лучшего понимания механизмов, участвующих в таких сообщениях ячеек. Большинство таких взаимодействий связаны паракринными или juxtacrine сигнализации между ячейками. Паракринными сигнализации включает секрецию специфических сигнальных факторов на одну ячейку, которые воспринимаются соответствующими рецепторами на другую ячейку в близости, вызывает ответ в нем9,10, тогда как juxtacrine сигнализации требует прямого контакта между клеточных компонентов две клетки участвуют11,12.
Такая сигнализация является ключевым компонентом в ткани гомеостаза, а также в микроокружения опухоли. Раковые клетки выгоду от паракринными и juxtacrine факторов от клеток в опухоли стромы, включая рак связанные фибробластов (CAFs), иммунные клетки и адипоцитов13,14,,1516. Паракринными сигнализации может быть опосредовано факторы роста, цитокины, chemokines, и т.д., в то время как juxtacrine сигнализации включает совмещенных лигандов и рецепторов в паз сигнализации, или взаимодействия между интегринов и их соответствующих белков внеклеточного матрикса. Мы продемонстрировали важность взаимного взаимодействия клетки рака яичников и CAFs в прогрессии и метастазированием опухоли14. Аналогичным образом взаимодействия метастазирующих клеток рака яичников с мезотелиальной клетки, охватывающих сайта метастазов регулировать ключевые микроРНК и факторы транскрипции в раковых клетках, которые способствуют метастатического колонизации17, 18.
Большинство исследований о сигнализации паракринными предполагают использование собранных из одной ячейки типа для лечения второй тип ячейки с кондиционером среды. Хотя такой подход широко использовался, он не эффективно реплицировать локализованные уровни высокой концентрации секретируемые фактора в микроокружения принимающей ячейки. Он также не удается воспроизвести кинетика непрерывного потока выделяется фактор, производится на одну ячейку и получил в соседней ячейке. Паракринными сигнализации является эффективным на коротких расстояниях, секретируемые факторов на необходимые концентрации только вблизи исходной ячейки и как правило диффузный и разбавлять как увеличивается расстояние. Этот локализованных высокая концентрация выделяется фактор необходимо вызвать ответ в рецепторов клеток. Кроме того в клетках получателя зависит ответ также баланс вновь выделяется факторов и их постоянное истощение деградации, привязки и интернализации в получателя клетки и диффузии от исходной ячейки. Кондиционерами носитель может быть сосредоточено на счет для более высокие концентрации локализованных в микроокружения, но это точно не может реплицировать точные концентрации. Кроме того он не может имитировать естественный кинетика производства и истощение фактором, связанным. Для более точно реплицировать паракринными сигнализации и отделить его от juxtacrine, сигнальные механизмы, мы разработали метод Роман проксимального отдела культуры, который предусматривает выращивание типы двух клеток на любой поверхности пористые мембраны. Поры достаточно малы, чтобы предотвратить juxtacrine взаимодействия и еще разрешить обмен секретируемые факторов на локализованные высокие концентрации. Таким образом эта система сохраняет кинетика производства и истощение паракринными факторов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Понимание механизма паракринными и juxtacrine сигнализации между ячейками имеет важное значение для улучшения знаний о нормальной ткани гомеостаза и болезней условия7,8. Большинство паракринными сигнализации что исследования проводятся путем сбора обуслов…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы в долгу перед пациентов за их участие в коллекции тканей для этих экспериментов. DoD OCRP яичников Рак Оскар (W81XWH-15-0253) и экспериментального награда от Коллин ‘s Dream Foundation Anirban K. Mitra поддержали это исследование.
Materials
| 24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert | Corning (Costar) | 3412 | • 10 µm thick translucent polycarbonate membrane • Treated for optimal cell attachment • Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case • Membrane must be stained for cell visibility • Sterilized by gamma radiation |
| 6 well plate | Corning (Falcon) | 353046 | Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid |
| 15 cm culture dish | Corning (Falcon) | 353025 | Sterile, TC-treated Cell Culture Dish |
| DMEM | Corning (Cellgro) | 10-013-CV | |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning (Cellgro) | 25-025-CI | |
| MEM Vitamins | Corning (Cellgro) | 25-020-CI | |
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Pipets | Any make is fine | ||
| CO2 Incubator | Any make is fine | ||
| Biosafety level II cabinet | Any make is fine | ||
| FN1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01549976_m1 | |
| TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs00998133_m1 | |
| CDH1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01023895_m1 | |
| GAPDH TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs99999905_m1 | |
| miRNeasy mini RNA isolation Kit | Qiagen | 217004 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 43-688-13 | |
| HeyA8 ovarian cancer cells | Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago | ||
| TGFβ Neutralizing Antibody | R&D Systems | MAB1835-100 |
Referenzen
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Cupedo, T., Mebius, R. E. Cellular interactions in lymph node development. The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).
- Suvas, S. Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis. The Journal of Immunology. 199 (5), 1543-1552 (2017).
- Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair. Methods in Molecular Biology. , 123-146 (2016).
- Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure. Heart Failure Reviews. 15 (6), 531-542 (2010).
- Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells – what challenges do they pose. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (7), 497-512 (2014).
- Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).
- Elenbaas, B., Weinberg, R. A. Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation. Experimental Cell Research. 264 (1), 169-184 (2001).
- Wilson, K. J., et al. EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling. Growth Factors. 30 (2), 107-116 (2012).
- Kopan, R. Notch signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).
- Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype. Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 32890-32901 (2007).
- Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Krebsforschung. 72 (10), 2473-2480 (2012).
- Mitra, A. K., et al. MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer. Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).
- Salimian Rizi, B., et al. Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells. Krebsforschung. 75 (2), 456-471 (2015).
- Mitra, A. K., et al. Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis. Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).
- Tomar, S., et al. ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase. Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).
- Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis Available from: https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination (2016)
- Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).
- Boelens, M. C., et al. Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways. Cell. 159 (3), 499-513 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
- Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment. Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).
