Eine proximale Kultur-Methode zu studieren, Parakrine Signale zwischen Zellen
Summary
Parakrine und Juxtacrine zelluläre Interaktionen spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen, einschließlich der Tumorprogression, Immunreaktionen, Angiogenese und Entwicklung. Hier ist eine proximale Kultur-Methode zur Untersuchung Parakrine Signalisierung wo sind die lokalisierten Konzentrationen der sezernierten Faktoren beibehalten und zelluläre Direktkontakt zu verhindern.
Abstract
Interzelluläre Wechselwirkungen spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen, einschließlich der Tumorprogression, Immunreaktionen, Angiogenese und Entwicklung. Parakrine oder Juxtacrine signalisieren vermittelt diese Wechselwirkungen. Die Verwendung eines konditionierten Mediums und Coculture Studien sind die am häufigsten verwendeten Methoden zur Unterscheidung zwischen diesen beiden Arten von Interaktionen. Jedoch die Wirkung der lokalisierten hohe Konzentrationen von sezernierten Faktoren in der Mikroumgebung während die Parakrine Interaktionen ist nicht exakt von konditionierten Medium zusammengefaßt und so zu ungenauen Ergebnissen führen kann. Um dieses Problem zu überwinden, haben wir eine proximale Kultur-Methode, um Parakrine Signalisierung studieren entwickelt. Die zwei Zelltypen werden entweder oberflächlich eine 10 µm dicken Polycarbonat-Membran mit 0,4 µm-Poren angebaut. Die Poren ermöglichen den Austausch von sezernierten Faktoren und zur gleichen Zeit hemmen Juxtacrine signalisieren. Die Zellen können gesammelt und am Endpunkt zu bestimmen, welche Auswirkungen die Parakrine Signalisierung lysiert. Darüber hinaus ermöglicht es für lokalisierte Konzentration Steigung von sezernierten Faktoren, ist diese Methode offen für Experimente mit längere Kultur sowie der Einsatz von Inhibitoren. Während wir diese Methode anwenden, um die Wechselwirkungen zwischen Eierstockkrebs Zellen und die Mesothelzellen stoßen sie auf der Website von Metastasen zu studieren, kann es zwei adhärente Zelltypen für Forscher, Parakrine Signalisierung in verschiedenen Bereichen zu studieren angepasst, einschließlich Tumor Mikroumgebung, Immunologie und Entwicklung.
Introduction
Die Rolle der produktive gegenseitige Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und der Tumor Mikroumgebung in Tumorprogression gut etabliert und ist ein wichtiger Schwerpunkt der Forschung auf Krebs Biologie1geworden. Ähnliche Fälle der bidirektionalen Signalisierung sind von entscheidender Bedeutung bei der Wundheilung, Immunreaktionen, Angiogenese, Stammzell-Nischen, und während der Entwicklung2,3,4,5,6 , 7 , 8. ein gemeinsames Thema in all diesen biologischen Prozessen ist, dass Zellen reagieren auf verschiedene Weise extrazelluläre Signale aus ihrer Mikroumgebung die Zelle Schicksal, Gewebe-Physiologie und Fortschreiten der Krankheit zu bestimmen. Daher hat der Fokus zunehmend wandte sich an ein besseres Verständnis der Mechanismen, die in solchen Zell-Zell-Kommunikation. Ein Großteil solcher Wechselwirkungen beinhalten Parakrine oder Juxtacrine Signale zwischen Zellen. Parakrine Signalisierung beinhaltet die Sekretion von bestimmten Signalisierung Faktoren durch eine Zelle, die durch entsprechende Rezeptoren auf eine andere Zelle in der Nähe,9,10, eine Reaktion in ihm auslöst, während Juxtacrine wahrgenommen werden Signalisierung erfordert direkten Kontakt zwischen zellulären Komponenten der beiden Zellen beteiligt11,12.
Diese Signalisierung ist eine entscheidende Komponente in Gewebe Homöostase sowie in der Tumor-Mikroumgebung. Die Krebszellen profitieren von Parakrine und Juxtacrine Faktoren von Zellen in der Tumor-Stroma, einschließlich Krebs-assoziierten Fibroblasten (CAFs), Immunzellen und Adipozyten13,14,15,16. Die Parakrine Signale von Wachstumsfaktoren, Zytokine, Chemokine, etc., vermittelt werden können, während der Juxtacrine signalisieren nebeneinander angeordneten Liganden und Rezeptoren wie Notch Signalisierung oder Wechselwirkungen zwischen Integrine und deren jeweilige beinhaltet extrazelluläre matrixproteine. Wir haben die Bedeutung der gegenseitigen Wechselwirkungen zwischen Eierstockkrebs Zellen und CAFs im Tumor Progression und Metastasierung14gezeigt. In ähnlicher Weise regulieren die Wechselwirkungen von metastasierenden Eierstockkrebs Zellen mit den auf der Website von Metastasen Mesothelzellen wichtige Mikro-RNAs und Transkriptionsfaktoren in den Krebszellen die metastatische Besiedlung17, zu fördern 18.
Die meisten Studien über Parakrine Signalisierung beinhalten die Verwendung eines konditionierten Mediums gesammelt von einem Zelltyp, die zweite Zelle Art mit zu behandeln. Während dieser Ansatz weit verbreitet wurde, ist es nicht effektiv lokalisierten hohe Konzentrationen des Faktors abgesondert in der Mikroumgebung von der Empfängerzelle repliziert. Es auch nicht reproduzieren die Kinetik der den kontinuierlichen Fluss des Faktors abgesondert von einer Zelle produziert und erhielt von der benachbarten Zelle. Parakrine Signalisierung über kurze Distanzen effektiv ist wie die sezernierten Faktoren in den erforderlichen Konzentrationen nur in der Nähe der Quellzelle sind und neigen zu diffundieren und verdünnen zunehmender Entfernung. Diese lokalisierten hohe Konzentration des Faktors sekretierten unbedingt eine Antwort in der Empfängerzelle ausgelöst. Darüber hinaus ist die Antwort in den empfängerzellen auch die Balance zwischen neu sezernierten Faktoren und ihre ständige Erschöpfung durch Abbau, Bindung und Internalisierung empfängerzellen und Verbreitung von der Quellzelle abhängig. Konditionierten Medium kann konzentrierter entfallen die höheren lokalisierten Konzentrationen in der Mikroumgebung vorhanden sein, aber, die nicht genau reproduzieren kann die genaue Konzentrationen. Darüber hinaus kann nicht es die natürliche Kinetik der Produktion und die Erschöpfung der beteiligten Faktor imitieren. Um genauer Parakrine Signalisierung zu replizieren und trennen Sie ihn von Juxtacrine signalisieren Mechanismen, haben wir eine neuartige proximalen Kultur-Methode entwickelt, die bringt die beiden Zelltypen entweder oberflächlich eine poröse Membran wachsen. Die Poren sind klein genug, um zu verhindern, dass Juxtacrine Interaktionen und noch ermöglichen den Austausch von sezernierten Faktoren bei lokalisierten hohen Konzentrationen. Auf diese Weise behält dieses System die Kinetik der Produktion und die Erschöpfung der Parakrine Faktoren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den Mechanismus der Parakrine und Juxtacrine Signale zwischen Zellen zu verstehen ist wichtig für die Entwicklung einer besseren Kenntnis des normalen Gewebes Homöostase und Krankheit Bedingungen7,8. Die meisten Parakrine signalisieren, dass durch das Sammeln von Studien sind konditioniert Medium aus einer Zelle Art und benutzen, um die anderen Zelltyp zu behandeln. Diese Methode hat einen Vorteil in seiner Einfachheit. Jedoch ist es nicht genau lokalisierten K…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind verpflichtet, den Patienten für ihre Teilnahme an der Gewebe-Sammlung für diese Experimente. Ein DoD OCRP Ovarian Krebs Oscar (W81XWH-15-0253) und ein pilot Award von Colleens Dream Foundation, Anirban K. Mitra unterstützt diese Forschung.
Materials
| 24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert | Corning (Costar) | 3412 | • 10 µm thick translucent polycarbonate membrane • Treated for optimal cell attachment • Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case • Membrane must be stained for cell visibility • Sterilized by gamma radiation |
| 6 well plate | Corning (Falcon) | 353046 | Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid |
| 15 cm culture dish | Corning (Falcon) | 353025 | Sterile, TC-treated Cell Culture Dish |
| DMEM | Corning (Cellgro) | 10-013-CV | |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning (Cellgro) | 25-025-CI | |
| MEM Vitamins | Corning (Cellgro) | 25-020-CI | |
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Pipets | Any make is fine | ||
| CO2 Incubator | Any make is fine | ||
| Biosafety level II cabinet | Any make is fine | ||
| FN1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01549976_m1 | |
| TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs00998133_m1 | |
| CDH1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01023895_m1 | |
| GAPDH TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs99999905_m1 | |
| miRNeasy mini RNA isolation Kit | Qiagen | 217004 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 43-688-13 | |
| HeyA8 ovarian cancer cells | Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago | ||
| TGFβ Neutralizing Antibody | R&D Systems | MAB1835-100 |
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