Um método de cultura Proximal para estudar a parácrina sinalização entre as células
Summary
Parácrina e justácrina interacções celulares desempenham um papel importante em muitos processos biológicos, incluindo a progressão do tumor, respostas imunes, angiogênese e desenvolvimento. Aqui, um método de cultura proximal é usado para estudar a sinalização parácrina onde as concentrações localizadas dos fatores secretados são mantidas, evitando o contato direto do celular.
Abstract
Interações intercelulares desempenham um papel importante em muitos processos biológicos, incluindo a progressão do tumor, respostas imunes, angiogênese e desenvolvimento. Parácrina ou sinalização justácrina Medeia tais interações. O uso de um meio condicionado e estudos coculture são os métodos mais comuns para discriminar entre estes dois tipos de interações. No entanto, o efeito de concentrações elevadas localizadas dos fatores secretados para o microambiente durante as interações parácrina não é instaurado com precisão por meio condicionado e, assim, pode levar a conclusões imprecisas. Para superar este problema, criámos um método de cultura proximal para estudar a sinalização parácrina. Os tipos de duas células são cultivados em qualquer superfície de uma membrana de policarbonato µm de espessura 10 com 0,4 µm de poros. Os poros permitem a troca de fatores secretados e, ao mesmo tempo, inibem a sinalização justácrina. As células podem ser coletadas e lysed no ponto de extremidade para determinar os efeitos da sinalização parácrina. Além de permitir para localizadas gradientes de concentração dos fatores secretados, este método é passível de experimentos que envolvem períodos prolongados de cultura, bem como o uso de inibidores. Enquanto nós usamos este método para estudar as interações entre as células de câncer de ovário e as células mesoteliais que encontram no local da metástase, pode ser adaptado para qualquer dois tipos de células aderentes aos pesquisadores estudar parácrina sinalização em vários campos, incluindo desenvolvimento, imunologia e microambiente do tumor.
Introduction
O papel de produtivas interações recíprocas entre as células cancerosas e o microambiente do tumor na progressão do tumor foi bem estabelecido e tornou-se um grande foco de pesquisa em câncer biologia1. Instâncias similares de sinalização bidirecional são cruciais durante o ferida cura, respostas imunes, angiogênese, nichos de células-tronco e desenvolvimento2,3,4,5,6 , 7 , 8. um tema comum em todos estes processos biológicos é que células respondem de várias maneiras para sinais extracelulares de seu microambiente que determinam o destino de celular, fisiologia do tecido e progressão da doença. Portanto, o foco tornou-se cada vez mais em direção a desenvolver uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos em tais comunicações célula-célula. A maioria de tais interações envolvem parácrina ou justácrina sinalização entre as células. Sinalização parácrina envolve a secreção de fatores específicos sinalização por uma célula que são percebidas pelos receptores correspondentes na outra célula na vizinhança, desencadeando uma resposta dentro de9,10, Considerando que justácrina sinalização requer o contato direto entre os componentes celulares das duas células envolvidas11,12.
Essa sinalização é um componente crucial na homeostase do tecido, bem como o microambiente do tumor. As células cancerosas beneficiam parácrina e justácrina fatores de células do estroma do tumor, incluindo cancro associado fibroblastos (CAFs), células do sistema imunológico e adipócitos13,14,15,16. A sinalização pode ser mediada por fatores de crescimento, citocinas, quimiocinas, etc., enquanto a sinalização justácrina envolve justapostos ligantes e receptores como sinalização Notch, ou interações entre integrinas e seus respectivos parácrina proteínas da matriz extracelular. Nós demonstramos a importância das interações recíprocas entre as células de câncer de ovário e CAFs no14, de progressão e metástase tumor. Da mesma forma, as interações de células de câncer de ovário metástase com as células mesoteliais, cobrindo o local da metástase regulam chave microRNAs e fatores de transcrição em células cancerosas que promovem a colonização metastático17, 18.
A maioria dos estudos na sinalização parácrina envolvem o uso de um meio condicionado coletado de tipo de uma célula para tratar o segundo tipo de célula com. Enquanto esta abordagem tem sido amplamente utilizada, ele não Replica eficazmente os níveis de alta concentração localizados do fator secretado no microambiente da célula receptora. Também não consegue reproduzir a cinética do fluxo contínuo do fator secretado sendo produzido por uma célula e recebido pela célula vizinha. Parácrina é eficaz em distâncias curtas, como os fatores secretados são nas concentrações necessárias apenas nas imediações da célula de origem e tendem a difundir e diluir para fora à medida que aumenta a distância de sinalização. Esta alta concentração localizada do fator secretado é essencial para desencadear uma resposta na célula do receptor. Além disso, a resposta nas células destinatários também é dependente o equilíbrio dos fatores secretados recentemente e seu esgotamento contínuo através de degradação, vinculação e internalização no destinatários células e difusão longe da célula de origem. Meio condicionado pode ser concentrado a conta para as altas concentrações localizadas presentes no microambiente, mas que exatamente não pode replicar as concentrações exatas. Além disso, ele não pode imitar a cinética natural de produção e depleção do fator envolvido. Para mais precisão replicar sinalização parácrina e separá-lo de justácrina mecanismos de sinalização, criámos um método de cultura proximal romance, que envolve os tipos de duas células em qualquer superfície de uma membrana porosa a crescer. Os poros são pequenos o suficiente para evitar interações justácrina e ainda permitir a troca de fatores secretados em concentrações elevadas localizadas. Dessa forma, este sistema retém a cinética da produção e depleção dos fatores parácrina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Compreender o mecanismo de parácrina e justácrina sinalização entre as células é essencial para o desenvolvimento de um melhor conhecimento do tecido normal homeostase e doença condições7,8. Parácrina a maioria dos estudos são conduzidos através da recolha de sinalização condicionado médio de uma célula tipo e usá-lo para tratar o outro tipo de célula. Este método tem uma vantagem em sua simplicidade inerente. No entanto, isso não com precisã…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos em dívida para com os pacientes para a sua participação na coleção de tecidos para estas experiências. Um prêmio de academia do DoD OCRP ovário câncer (W81XWH-15-0253) e um piloto prêmio da Fundação de sonho de Colleen para Anirban K. Mitra apoiaram esta pesquisa.
Materials
| 24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert | Corning (Costar) | 3412 | • 10 µm thick translucent polycarbonate membrane • Treated for optimal cell attachment • Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case • Membrane must be stained for cell visibility • Sterilized by gamma radiation |
| 6 well plate | Corning (Falcon) | 353046 | Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid |
| 15 cm culture dish | Corning (Falcon) | 353025 | Sterile, TC-treated Cell Culture Dish |
| DMEM | Corning (Cellgro) | 10-013-CV | |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning (Cellgro) | 25-025-CI | |
| MEM Vitamins | Corning (Cellgro) | 25-020-CI | |
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Pipets | Any make is fine | ||
| CO2 Incubator | Any make is fine | ||
| Biosafety level II cabinet | Any make is fine | ||
| FN1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01549976_m1 | |
| TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs00998133_m1 | |
| CDH1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01023895_m1 | |
| GAPDH TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs99999905_m1 | |
| miRNeasy mini RNA isolation Kit | Qiagen | 217004 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 43-688-13 | |
| HeyA8 ovarian cancer cells | Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago | ||
| TGFβ Neutralizing Antibody | R&D Systems | MAB1835-100 |
Referenzen
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Cupedo, T., Mebius, R. E. Cellular interactions in lymph node development. The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).
- Suvas, S. Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis. The Journal of Immunology. 199 (5), 1543-1552 (2017).
- Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair. Methods in Molecular Biology. , 123-146 (2016).
- Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure. Heart Failure Reviews. 15 (6), 531-542 (2010).
- Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells – what challenges do they pose. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (7), 497-512 (2014).
- Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).
- Elenbaas, B., Weinberg, R. A. Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation. Experimental Cell Research. 264 (1), 169-184 (2001).
- Wilson, K. J., et al. EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling. Growth Factors. 30 (2), 107-116 (2012).
- Kopan, R. Notch signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).
- Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype. Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 32890-32901 (2007).
- Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Krebsforschung. 72 (10), 2473-2480 (2012).
- Mitra, A. K., et al. MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer. Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).
- Salimian Rizi, B., et al. Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells. Krebsforschung. 75 (2), 456-471 (2015).
- Mitra, A. K., et al. Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis. Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).
- Tomar, S., et al. ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase. Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).
- Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis Available from: https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination (2016)
- Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).
- Boelens, M. C., et al. Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways. Cell. 159 (3), 499-513 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
- Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment. Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).
