الفصل بين "السبانخ ثايلاكويد البروتين المجمعات" بالتفريد هلام الأخضر الأصلي وتوصيف الفرقة استخدام "العد فوتون واحد تيميكوريلاتيد"
Summary
نقدم هنا بروتوكولا لفصل مجمعات ثايلاكويد solubilized بالتفريد “هلام الأخضر الأصلي”. العصابات الخضراء جل تتميز في وقت لاحق بالوقت ارتباطاً وحيد فوتون العد (تكسبك) ويتم توفير الخطوات الأساسية لتحليل البيانات.
Abstract
تنفذ سلسلة من المجمعات المصطبغة البروتين في الأغشية ثايلاكويد ردود فعل الضوء لعملية التمثيل الضوئي. Stoichiometry، وتنظيم هذه المجمعات ديناميكية للغاية منذ فترة طويلة وجداول زمنية قصيرة نتيجة لعمليات التكيف مع عملية التمثيل الضوئي إلى تغيير الظروف البيئية (أي تبريد غير الضوئية، والتحولات في الدولة، استجابة طويلة الأجل). تاريخيا، وقد وصف هذه العمليات سبيكتروسكوبيكالي من حيث التغييرات في الأسفار الكلوروفيل، والتحليل الطيفي ويظل وسيلة حيوية لرصد البارامترات التمثيل الضوئي. وهناك عدد محدود من الطرق التي يمكن تصور الديناميات المعقدة البروتين الأساسي. هنا يصف لنا طريقة سريعة وبسيطة لفصل عالية الاستبانة والتصور من مجمعات ثايلاكويد، التفريد هلام الأخضر الأصلي. ويقترن هذا الأسلوب فوتون واحد يرتبط وقت العد لتوصيف مفصل خصائص fluorescence الكلوروفيل العصابات مفصولة عن الجل الأخضر.
Introduction
يجب ضبط التمثيل الضوئي في الكائنات الحية باستمرار علم وظائف الأعضاء إلى تغيير الظروف البيئية تحقيق أقصى قدر من الإنتاجية والتنافس بنجاح مع الجيران1. وهذا ينطبق بشكل خاص للآلية المسؤولة عن ردود فعل الضوء لعملية التمثيل الضوئي، كالضوء العام الشروط يمكن أن تتقلب بثلاثة أوامر من حجم بين الظلال وأشعة الشمس الكاملة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تقلل من العوامل البيئية مثل الجفاف أو البرد أو الإجهاد الحراري توافر غاز ثاني أكسيد الكربون لتثبيت الكربون، وهو الحوض إلكترون الطبيعية للمنتجات من ردود فعل الضوء. النباتات يجب، ولذلك الحصاد واستخدام الإشعاع الشمسي أكبر قدر ممكن من الكفاءة مع الاحتفاظ بالقدرة على تبديد الطاقة الخفيفة الزائدة حسب الضرورة. وفي حين فوتوكسيداتيفي الضرر لا يزال يحدث بشكل روتيني تحت جميع ظروف الإضاءة2،3، الفشل في إدارة الطاقة الإثارة استيعابها بنجاح يمكن أن يؤدي إلى تلف الخلايا كارثية والموت. وتوجد عدة آليات التكيف التي تسمح لجهاز التمثيل الضوئي ضبطها للتغيرات في الظروف البيئية السائدة ولتقلبات عابرة (أي، على مدى فترات زمنية طويلة وقصيرة على حد سواء)4. وتشمل هذه استجابة طويلة الأجل (لاتينية) وتبريد غير الضوئية (نبق). نبق في حد ذاته يعتبر أن تشمل على الأقل ثلاثة ظواهر المكون الأخرى، بما في ذلك حالة الانتقال (كيو تي) والطاقة إيندوسيبلي سرعة التبريد (qE) فوتوينهيبيشن (تشي)5.
لاحظ هذه العمليات والمعرفة إلى حد كبير فيما يتعلق بالظواهر الطيفية أصلاً [مثل نبق يشير إلى انخفاض في الأسفار الكلوروفيل الملاحظة (تبريد للأسفار الكلوروفيل) ليس بسبب زيادة في المعدل الكيمياء الضوئية]6. وبالمثل يشير مصطلح “انتقالات الحالة” إلى التغيير الملحوظ في قدر نسبي من الأسفار من هذه المبادرة، وبسيي7. بينما التقنيات الطيفية التي مكنت من تعداد هذه الظواهر [على وجه الخصوص، السعة نبض التضمين الطيفي الفلورية (بام)] ويستمر أن يكون وسيلة حيوية لرصد وتحليل عمليات التمثيل الضوئي في فيفو، قدرا كبيرا من الكيمياء الحيوية مطلوب توضيح الآليات الكامنة وراء هذه الملاحظات الطيفية. على سبيل المثال، يتضمن انتقالات الدولة، دورة الفسفرة/ديفوسفوريليشن من البروتينات لهسيي كيناز STN7 والفوسفاتيز TAP38/PPH1، على التوالي8،،من910. يضبط هذا الدورة التوزيع المادي للهوائي لهسيي بين فوتوسيستيمس اثنين بنقل جزء من أرتب لهسيي من بسيي لهذه المبادرة، وبالتالي تغيير الامتصاص المقطع العرضي لل11،فوتوسيستيمس12. سرعة تحويل عنصر التيسير الكمي لنبق الطاقة الإثارة الزائدة في الحرارة من خلال إجراءات دورة إبوكسدة/دي-إبوكسدة فيولاكسانثين/تين وزياكسانثين والبروتين الهيئات الفرعية الرئيسية. الدور المحدد للهيئات الفرعية الرئيسية في هذه العملية لا يزال لا يفهم تماما13. عنصر تشي لنبق، فوتوينهيبيشن، يعزى عموما إلحاق الضرر بالبروتين D1 من بسيي. استعادة صلاحية كاملة التمثيل الضوئي يتطلب عملية إصلاح وضع لإصلاح تلف بسيي فوتوسينتيرس. دورة إصلاح بسيي ينطوي على هجرة مجمعات بسيي من مداخن جرانال، تفكيك المجمعات، واستبدال التالفة D1 البروتينات، إعادة تجميع مجمعات بسيي، والحركة من مجمعات بسيي العودة إلى الكدسات جرانال14. ويظل الطابع الدقيق فوتوينهيبيشن وبسيي د موضوع تدقيق مكثف15.
الصعوبة في دراسة ظواهر مثل الدولة والتحولات أو إصلاح بسيي ينبع جزئيا من حقيقة أن هناك لا أحد طريقة بسيطة لتصور آليات النظم البيوكيميائية المعقدة. أن النهج البيوكيميائية الكلاسيكية لفهم عملية أول فصل مكوناته حتى أنه يمكن أن توصف بأنها تعيش في عزلة. نشأت التفريد جل أصلي من الجهود الناجحة في الثمانينات إلى فصل وتميز مجمعات photosystem من الأغشية ثايلاكويد بأكثر الأساليب محضرة (هما السكروز التدرج الطرد المركزي والفصل اللوني)16. النظم المنظفات التي وضعت لجعل بلطف مجمعات السكان الأصليين من الأغشية ثايلاكويد كانت قريبا تتكيف طرق فصل الغرواني الكهربي، أبرزها ستاهلين والين17 وو ثورنبير وبيتر18، مما يثير للتفريد هلام الأخضر الأصلي. وفي حين تمثل واحدة فقط من مجموعة متنوعة من التقنيات في ترسانة التجريبية، الصفحة الأصلية لديها عدد من الخصائص الجذابة التي جعلت من أسلوب العاملين على نطاق واسع في بحوث عملية التمثيل الضوئي. الصفحة الأصلية نسبيا سريعة وبسيطة، تتطلب معدات متخصصة قليلاً، بينما توفر عالية الدقة فصل عدد كبير من مجمعات ثايلاكويد في وقت واحد. وهذا يجعل الصفحة الأصلية أداة ملائمة لدراسة ديناميات ثايلاكويد، وعندما يقترن صفحة قياسية في البعد الثاني، فضلا عن مجموعة متنوعة من نظم المنظفات والمخزن المؤقت، نظام متعدد الاستخدامات لإيجاد وتميز جديد ثايلاكويد المجمعات.
أن يقال، الجل الأخضر الأصلي كان سمعة لكونه أسلوباً غير موثوق بها، لا سيما في أيدي عديمي الخبرة، كما أنه من السهل لإنتاج النتائج السيئة التي تتكون من المواد الهلامية غامض، ملطخ مع العصابات القليلة. تم حل هذه المشكلة، في جزء منه، مع الأخذ بأصلي الأزرق-الصفحة19. استخدام صبغة كوماسي في النظام المخزن المؤقت BN يجعل فصل البروتين أكثر قوة. ولذلك، BN-الصفحة في كثير من الأحيان أسلوب أسهل وأكثر موثوقية للمبتدئين نسبية لإعداد ويمكن توفير نسخ فصل الألوان عالية الدقة لمجمعات ثايلاكويد. لهذه الأسباب، أصبحت BN-الصفحة الأسلوب المفضل لمعظم العمل في هذا الميدان. بينما BN-الصفحة أبطأ عموما لتشغيل من التفريد هلام الأخضر، العيب الرئيسي فيها أن تلطيخ صبغة كوماسي يتداخل مع تحديد العصابات التي تحتوي على الكلوروفيل باهتة، بينما أيضا مما يجعل المتلقين للمعلومات الطيفية توصيف إشكالية.
المعلومات البيوكيميائية التي قدمتها الهلام الأصلي ويمكن تعزيز مخزونات النشر الاستراتيجي 2D-الصفحة إلى حد كبير عندما جنبا إلى جنب مع بيانات من التقنيات الطيفية. بغض النظر عن النظام المستخدم، مشكلة مركزية مع استخدام المواد الهلامية الأصلية لتحديد المجمعات هو أنه يمكن دائماً الطعن في تحديد (أي، العثور على البروتينات في فرقة يمكن أن يمثل دائماً مجمعات كوميجراتينج أو مكوناتها، بدلاً من ذلك من مجمع فسيولوجيا أصيلة واحدة.) توصيف الطيفية يوفر المعلومات الفيزيائية الحيوية حول الأصباغ في نطاقات هلام الأخضر ويمكن استخدامها لتحديد ما هي أنواع المجمعات التي من المحتمل أن تحتوي على. الأسفار الكلوروفيل مفيد بشكل خاص في هذا الصدد نظراً لأطياف مختلفة إلى حد كبير غالباً وإعمار الأسفار التي تتميز بها مجمعات البروتين صبغات التمثيل الضوئي المختلفة. الحديثة فوتون واحد يرتبط وقت العد (تكسبك) بينما الأطياف fluorescence حالة ثابتة بسيطة ك 77 تاريخيا مفيدة في تأكيد هويات مجمعات جل الأصلي، يمكن أن توفر معلومات أكثر بكثير. تكسبك تسمح ليس فقط توصيف المجمعات استناداً إلى عمر الأسفار، ولكن أيضا يجعل من الممكن وصف مفصل لنقل الطاقة بين المكونات الطيفية داخل مجمع. أصبح ضروريا بصورة متزايدة كاستخدام هلام الأصلي مختلف نظم ينتشر هذا النوع من الوصف ومجمعات المفترضة جديدة يتم اكتشافها، يسمح بتحديد البروتين المجمعات مصادقة أفضل وتقديم الجديد المعلومات الفيزيائية الحيوية حول كيفية عمل هذه المجمعات.
في هذه الورقة نقدم أسلوب الذي يسمح للجهات الأخرى التي لها خبرة قليلة أو لا مع التفريد جل أصلي لتحقيق نوعية عالية القرار مجمعات ثايلاكويد الأصلية لغرض التحقيق وميكانيكا ردود فعل الضوء عملية التمثيل الضوئي. ويمكن زيادة هذه التقنية الأساسية ثم المجرب السلطة التقديرية لتحسين النتائج، أو توسيع نطاق تطبيقها على الأنواع الأخرى. ثم يصف لنا عملية إخضاع العصابات هلام الأخضر الأصلي تكسبك، فضلا عن بعض الخطوات للتحليل الأساسي والعرض التقديمي للبيانات المقدمة من هذه التقنية. ويمتد اقتران التفريد جل أصلي مع تحليل تكسبك الأداة المساعدة هذه الأنظمة الهلام بتوفير المصادقة وتوصيف الفيزيائية الحيوية للبروتين المجمعات داخل العصابات. هلام الأخضر الموصوفة هنا هو يستند النظام التي وضعتها ستاهلين والين17 مع إدخال بعض التعديلات عليها، وهو نفسه الذي يستخدم في شفارتز وآخرون. 20-هذا النظام هو واحد من كثير لكن محددة من الميزات التي تعتبر مفيدة لهذه المنهجية. أنها سريعاً ما فيه الكفاية حتى أن ثايلاكويد العزلة وجل التفريد، وتكسبك تحليل مناسب يمكن أن يؤديها في يوم واحد، تفادي المشاكل المحتملة لتخزين العينات والتدهور. كما نجد أن هذا الأسلوب قوية في أيدي المستخدمين الذين تنقصهم الخبرة، في حين لا تزال تقدم النتائج التي تتراوح من جيدة إلى الأعلى، تبعاً لدرجة التحسين.
من المهم أن نضع في اعتبارنا أن المجمعات تصور في جل أصلية تعتمد على نظم كل من المنظفات والمخزن المؤقت المستخدمة، فضلا عن بيولوجيا الكائنات الحية تحت التحقيق. فصل مختلف النظم المنظفات والمخزن المؤقت تفضيلي أنواع مختلفة من المجمعات، وكائن التمثيل الضوئي معين سيكون مجمعات مختلفة من الكائنات الحية الأخرى، ليست جميعها سوف تكون موجودة تحت أي ظرف من الظروف. النظام المذكور هنا مناسبة خاصة لدراسة هذه المبادرة ميجاكومبليكسيس، كما هو موضح في شفارتز وآخرون. 20، ولكن يقع على نهاية المزعزع للاستقرار أكثر من الطيف لأولئك الذين يدرسون ميجاكومبليكسيس بسيي. لإجراء دراسة شاملة لمختلف النظم المنظفات والمخزن المؤقت المستخدمة في التفريد جل أصلي من البروتينات ثايلاكويد، يوصي باستعراض Järvi وآخرون. 21 ورانتالا et al. 22.
Protocol
Representative Results
Discussion
سيؤدي إلى solubilization ثايلاكويد الناجحة، وجل الأصلي تشغيل حل عدة أشرطة مرئية متميزة الخضراء في الجل دون تشويه كبير أو تلطيخ من العصابات. التحميل الزائد للهلام، منظفات عالية تركيز، درجة حموضة عينة غير صحيحة، أونديسولفيد المادية وتشغيل الهلام سريعاً جداً أو في درجة حرارة عالية جداً، وجل سكب غ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم توفير التمويل والدعم من قسم الكيمياء في جامعة ولاية ميشيغان.
Materials
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Tris base | Sigma | #648310 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Decyl Maltoside | Sigma | D7658 | n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside |
| Octyl Glucoside | Sigma | O8001 | |
| Acrylamide | BioRad | 161-0148 | 37.5/1 C 40% solution |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| Ammonium Persulfate | BioRad | 161-0700 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 |
Referenzen
- Yamori, W. Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress. Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).
- Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions). Plant Physiology. 103 (1), 181-189 (1993).
- Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. M. Turnover of the photosystem II D1 protein in higher plants under photoinhibitory and nonphotoinhibitory irradiance. Journal of Biological Chemistry. 268 (34), 25476-25482 (1993).
- Dietze, l. L., Bräutigam, K., Pfannschmidt, T. Photosynthetic acclimation: state transitions and adjustment of photosystem stoichiometry-functional relationships between short-term and longterm light quality acclimation in plants. FEBS Journal. 275 (6), 1080-1088 (2008).
- Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. Regulation of light harvesting in green plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 655-684 (1996).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology. 59, 89-113 (2008).
- Williams, W. P. Spatial organization and interaction of the two photosystems in photosynthesis. Nature. 225 (5239), 1214-1217 (1970).
- Bellafiore, S., Barneche, F., Peltier, G., Rochaix, J. D. State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7. Nature. 433 (7028), 892-895 (2005).
- Shapiguzov, A., et al. The PPH1 phosphatase is specifically involved in LHCII dephosphorylation and state transitions in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (10), 4782-4787 (2010).
- Pribil, M., Pesaresi, P., Hertle, A., Barbato, R., Leister, D. Role of plastid protein phosphatase TAP38 in LHCII dephosphorylation and thylakoid electron flow. Public Library of Science Biology. 8 (1), (2010).
- Larsson, U. K., Jergil, B., Andersson, B. Changes in the lateral distribution of the light-harvesting chlorophyll-a/b-protein complex induced by its phosphorylation. European Journal of Biochemistry. 136 (1), 25-29 (1983).
- Minagawa, J. State transitions–the molecular remodeling of photosynthetic supercomplexes that controls energy flow in the chloroplast. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (8), 897-905 (2011).
- Ruban, A. V. Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage. Plant Physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).
- Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 159-168 (2005).
- Li, L., Aro, E. M., Millar, A. H. Mechanisms of Photodamage and Protein Turnover in Photoinhibition. Trends in Plant Science. , (2018).
- Dunahay, T. G., Staehelin, L. A. Isolation of photosystem I complexes from octyl glucoside/sodium dodecyl sulfate solubilized spinach thylakoids: characterization and reconstitution into liposomes. Plant Physiology. 78 (3), 606-613 (1985).
- Allen, K. D., Staehelin, L. A. Resolution of 16 to 20 chlorophyllprotein complexes using a low ionic strength native green gel system. Analytical Biochemistry. 194 (1), 214-222 (1991).
- Peter, G. F., Thornber, J. P. Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (25), 16745-16754 (1991).
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
- Schwarz, E. M., Tietz, S., Froehlich, J. E. Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants. Photosynthesis Research. 136 (1), 107-124 (2018).
- Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439 (2), 207-214 (2011).
- Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92 (5), 951-962 (2017).
- Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).
