Separazione di spinaci Thylakoid complessi proteici da nativo verde Gel elettroforesi e caratterizzazione di banda utilizzando Time-Correlated Single Photon Counting

Summary

Qui presentiamo un protocollo per separare solubilizzate thylakoid complessi mediante elettroforesi in Gel verde nativo. Gel verde bande successivamente sono caratterizzati da tempo correlato Single Photon Counting (TCSPC) e vengono forniti i passaggi base per l’analisi dei dati.

Abstract

Le reazioni di luce di fotosintesi sono effettuate da una serie di complessi proteici pigmentati nelle membrane tilacoidali. La stechiometria e l’organizzazione di questi complessi è altamente dinamico su sia in lungo che in breve tempo scale a causa di processi che si adattano fotosintesi al mutare delle condizioni ambientali (cioè, non-fotochimica tempra, transizioni di stato e la risposta a lungo termine). Storicamente, questi processi sono stati descritti spettroscopicamente in termini di cambiamenti in fluorescenza della clorofilla, e spettroscopia rimane un metodo fondamentale per il monitoraggio di parametri fotosintetici. Ci sono un numero limitato di modi in cui possono essere visualizzate le sottostanti dinamiche complesse della proteina. Qui descriviamo un metodo semplice e veloce per la separazione ad alta risoluzione e visualizzazione di thylakoid complessi, elettroforesi del gel verde nativo. Questo metodo è accoppiato con correlati nel tempo singolo fotone conteggio per la dettagliata caratterizzazione delle proprietà di fluorescenza clorofilla di bande separate sul gel verde.

Introduction

Gli organismi fotosintetici devono regolare costantemente la loro fisiologia alle mutevoli condizioni ambientali, per massimizzare la loro produttività e competere con successo con i vicini¹. Questo è particolarmente vero per il macchinario responsabile per le reazioni di luce della fotosintesi, come luce ambientale condizioni possono fluttuare da tre ordini di grandezza tra ombre e pieno sole. Inoltre, fattori ambientali, come siccità, freddo o lo stress da calore possono ridurre la disponibilità di anidride carbonica per la fissazione del carbonio, che è il lavandino elettrone naturale per i prodotti delle reazioni luce. Piante devono, pertanto, raccolto e utilizzano la radiazione solare nel modo più efficiente possibile pur mantenendo la capacità di dissipare l’eccesso di energia luce necessaria. Mentre danno photooxidative persiste ordinariamente sotto tutte le condizioni di luce^2,3, l’incapacità di gestire energia di eccitazione assorbita correttamente può portare a danni catastrofici delle cellule e la morte. Parecchi meccanismi adattivi esistono che permettono l’apparato fotosintetico essere sintonizzato sia cambiamenti nelle condizioni ambientali prevalenti e a fluttuazioni transitoria (cioè, più brevi e lunghi periodi di tempo)⁴. Questi includono la risposta a lungo termine (LTR) e non-fotochimica tempra (NPQ). NPQ è di per sé considerato a comprendere almeno tre altri fenomeni di componente, incluse le transizioni di stato (qT) ed energia rapidamente viscoelastica tempra (qE) fotoinibizione (qI)⁵.

Questi processi sono stati originariamente osservati e definiti in gran parte in termini di fenomeni spettroscopici [ad es., NPQ si riferisce a una goccia in fluorescenza clorofilla osservati (estinzione della fluorescenza della clorofilla) che non è dovuto ad un aumento del tasso di fotochimica]⁶. Il termine “transizioni di stato” si riferisce allo stesso modo al cambiamento osservato nella relativa quantità di fluorescenza da PSI e PSII⁷. Mentre le tecniche spettroscopiche che hanno reso possibile la enumerazione di questi fenomeni [in particolare, ampiezza di impulso modulata spettroscopia di fluorescenza (PAM)] e continuano ad essere uno strumento fondamentale per l’osservazione e la dissezione di processi fotosintetici in vivo, un ottimo affare di biochimica è richiesto per delucidare i meccanismi alla base di queste osservazioni spettroscopiche. Le transizioni di stato, per esempio, prevede un ciclo di fosforilazione/defosforilazione delle proteine LHCII dal STN7 chinasi e fosfatasi TAP38/PPH1, rispettivamente^8,9,10. Questo ciclo di regola la distribuzione fisica dell’antenna LHCII tra due fotosistema spostando una parte dei trimeri LHCII da PSII PSI, modificando in tal modo l’assorbimento sezione trasversale del fotosistema^11,12. Il componente qE di NPQ converte rapidamente energia di eccitazione in eccesso in calore attraverso le azioni del ciclo epossidazione/de-epossidazione violaxantina/zeaxantina e la proteina PsbS. Il ruolo esatto di PsbS in questo processo è ancora non pienamente compreso¹³. Il componente di qI di NPQ, fotoinibizione, è generalmente attribuito a danneggiare la proteina D1 del PSII. Restauro di competenza piena fotosintetico richiede un processo di riparazione elaborati per fissare danneggiato PSII photocenters. Il ciclo di riparazione PSII comporta la migrazione dei complessi PSII fuori il granal pile, smantellamento dei complessi, sostituzione di proteine danneggiate D1, rimontaggio dei complessi PSII e movimento dei complessi PSII nuovamente dentro il pile granal¹⁴. L’esatta natura di fotoinibizione e PSII photodamage rimane un argomento di esame accurato intenso¹⁵.

La difficoltà nello studio di fenomeni come stato transizioni o riparazione PSII deriva in parte dal fatto che c’è un modo semplice per visualizzare la meccanica dei sistemi biochimici complessi. Il classico approccio biochimico per comprendere un processo consiste nel separare prima suoi componenti in modo che essi possono essere caratterizzati in isolamento. Elettroforesi del gel nativo è sorto da iniziative di successo nel 1980 per separare e caratterizzano i complessi di fotosistema dalle membrane tilacoidali con più metodi preparativa (vale a dire la centrifugazione in gradiente di saccarosio e la cromatografia)¹⁶. I detergenti sistemi sviluppati per solubilizzare delicatamente i complessi nativi dalle membrane tilacoidali presto sono stati adattati ai metodi di separazione elettroforetica, in particolare da Allen e Staehelin¹⁷ ed e Peter e Thornber¹⁸, dando luogo a Natale verde gel elettroforesi. Mentre che rappresentano solo uno di una varietà di tecniche nell’arsenale sperimentale, PAGE nativo ha un numero di caratteristiche che lo hanno reso un metodo ampiamente impiegato nella ricerca di fotosintesi. PAGINA nativo è relativamente veloce e semplice, che richiede attrezzature poco specializzata, fornendo contemporaneamente separazione di alta risoluzione di un gran numero di complessi thylakoid. Questo rende la pagina nativa un comodo strumento per studiare thylakoid dinamica e, quando combinato con pagina standard nella seconda dimensione, nonché una varietà di sistemi tampone e detergente, un sistema versatile per trovare e caratterizzare nuovi thylakoid complessi.

Detto questo, gel verde nativo hanno avuto la reputazione di essere una tecnica inaffidabile, soprattutto in mani inesperte, in quanto è facile produrre scarsi risultati composto da gel fuzzy, untuosa con poche bande. Questo problema è stato risolto, in parte, con l’introduzione del blu-natale pagina¹⁹. L’uso della tintura di coommassie nel sistema di buffer BN rende la separazione delle proteine più robusto. Di conseguenza, BN-PAGE è spesso una tecnica più semplice e affidabile per un novizio relativa impostare e separazioni di alta risoluzione di thylakoid complessi in grado di fornire. Per questi motivi, BN-PAGE è diventato il metodo di scelta per la maggior parte del lavoro di questo campo. BN-PAGE è generalmente più lento per l’esecuzione di elettroforesi del gel di colore verde, il suo principale svantaggio è che la colorazione di tintura coommassie interferisce con l’identificazione delle fasce deboli contenenti clorofilla, rendendo anche a valle spettroscopiche caratterizzazione problematico.

Le informazioni biochimiche fornite da gel nativo e SDS-PAGE 2D può essere notevolmente rafforzata quando combinati con dati di tecniche spettroscopiche. Indipendentemente dal sistema impiegato, un problema centrale con l’utilizzo di gel nativo per identificare complessi è che l’identificazione può sempre essere impugnata (cioè, le proteine trovate in una band potrebbe sempre rappresentare comigrating complessi o componenti, piuttosto di un unico complesso fisiologicamente autentico). Caratterizzazione spettroscopica fornisce informazioni biofisiche i pigmenti in bande di gel verde e può essere utilizzato per determinare quali tipi di complessi sono propensi a contenere. Fluorescenza della clorofilla è particolarmente utile a questo proposito a causa della spesso drammaticamente differenti spettri e durate di fluorescenza che sono caratteristici dei complessi pigmento-proteici fotosintetici differenti. Mentre gli spettri di fluorescenza di semplice allo steady-state 77K sono stati storicamente utili nel confermare l’identità dei complessi di Natale del gel, moderno correlati nel tempo singolo fotone conteggio (TCSPC) è in grado di fornire molte più informazioni. TCSPC permette non solo la caratterizzazione di complessi basati sulla durata di fluorescenza, ma rende anche possibile la descrizione dettagliata del trasferimento di energia tra componenti spettrali all’interno di un complesso. Questo tipo di caratterizzazione sta diventando sempre più necessario come l’uso di varie creme di sistemi di Natale del gel e vengono scoperti nuovi presunti complessi, permettendo l’identificazione di complessi proteici di meglio essere autenticati e offrire nuovi biofisiche informazioni sul funzionano di questi complessi.

In questo articolo forniamo un metodo che permette a coloro che hanno poca o nessuna esperienza con elettroforesi nativa per ottenere alta qualità risoluzione dei nativi thylakoid complessi allo scopo di indagare i meccanismi delle reazioni di luce fotosintesi. Questa tecnica di base può poi essere aumentata a discrezione dello sperimentatore di migliorare i risultati o estendere l’applicabilità di altre specie. Quindi si descrive il processo per il soggetto bande di gel verde nativo di TCSPC, come pure alcuni passaggi per analisi di base e la presentazione dei dati forniti dalla tecnica. L’accoppiamento di elettroforesi nativa con analisi TCSPC estende l’utilità di questi sistemi di gel fornendo l’autenticazione e la caratterizzazione biofisica dei complessi della proteina all’interno delle fasce. Il sistema gel verde qui descritto si basa su che sviluppato da Allen e Staehelin¹⁷ con alcune modifiche ed è lo stesso di quello utilizzato in Schwarz et al. ²⁰. questo sistema è uno dei tanti, ma ha caratteristiche specifiche che sono utili per questa metodologia. È abbastanza veloce in modo che thylakoid isolamento, elettroforesi del gel e l’analisi TCSPC conveniente può essere eseguite in un solo giorno, prevenendo potenziali problemi di conservazione dei campioni e la degradazione. Troviamo anche che questo metodo è robusto nelle mani di utenti inesperti, pur fornendo risultati che vanno dal buono al superiore, a seconda del grado di ottimizzazione.

È importante da tenere a mente che i complessi visualizzati su un gel nativo dipendono da sistemi tampone sia il detergente utilizzati, nonché sulla biologia dell’organismo in esame. Diversi sistemi tampone e detergente preferenzialmente separano diversi tipi di complessi, e un dato organismo fotosintetico avrà diversi complessi da altri organismi, dei quali non tutti saranno presenti sotto qualsiasi circostanza. Il sistema qui descritto è particolarmente adatto allo studio del PSI megacomplexes, come descritto in Schwarz et al. ²⁰, ma cade sull’estremità più destabilizzante dello spettro per coloro che studiano PSII megacomplexes. Per uno studio completo dei vari sistemi tampone e detergente utilizzato nel Natale del gel elettroforesi delle proteine tilacoide, si consiglia di rivedere Järvi et al. ²¹ e Rantala et al. ²².

Protocol

1. magazzino soluzioni preparazione per colata gel verde nativo Preparare una soluzione tampone concentrata di 4x per la risoluzione di gel composto da 40% glicerolo, glicina di 200 mM e 100 mM Tris tamponato a pH 8.3. Preparare una soluzione tampone concentrata di 4x per stacking gel composto da 40% glicerolo, glicina di 200 mM e 100 mM Tris tamponato a pH 6,3. Memorizzare i buffer a 4 ° C per prevenire la crescita di muffa.Nota: I buffer sono stabili per mesi a 4 ° C, quindi è consi…

Representative Results

Risultati rappresentativi per elettroforesi del gel di colore verde sono presentati nella Figura 1. Lane 1 fornisce un esempio di risultati ideali per elettroforesi del gel verde di spinaci tilacoidi, in cui è visibile un numero massimo di bande verdi chiare e nitide. Questi risultati sono un po’ atipici, in parte perché non tutte le bande vista nel vicolo 1 sono normalmente presenti in un dato campione. Pulitura di esempio aggiuntivi, sotto forma di isolam…

Discussion

Un successo thylakoid solubilizzazione e Natale gel eseguire comporterà la risoluzione di più distinte bande verde visibile sul gel senza distorsione significativa o sbavature delle bande. Sovraccaricare il gel, un’alta concentrazione di detersivo, un pH di esempio errato, non disciolto materiale, correre il gel troppo rapidamente o ad una temperatura troppo elevata, e un gel indebitamente versato sono tutti fattori che possono contribuire alla mal risolto thylakoid complessi. Ottimizzando le condizioni del gel stesso …

Materials

Glycine	Sigma	G8898
Tris base	Sigma	#648310
SDS	Sigma	L3771
Decyl Maltoside	Sigma	D7658	n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside
Octyl Glucoside	Sigma	O8001
Acrylamide	BioRad	161-0148	37.5/1 C 40% solution
TEMED	BioRad	161-0800
Ammonium Persulfate	BioRad	161-0700
Magnesium Chloride	Sigma	M2670
Potassium Chloride	Sigma	P9333