利用本地绿色凝胶电泳分离菠菜类黄体蛋白配合物, 用时间相关单光子计数表征
Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以分离溶解性类囊化复合物的本地绿色凝胶电泳。绿色凝胶带随后通过时间相关单光子计数 (tcspc) 进行了表征, 并提供了数据分析的基本步骤。
Abstract
光合作用的光反应是由囊状细胞膜中的一系列色素蛋白复合物进行的。由于光合作用适应不断变化的环境条件 (即非光化学淬火、状态转换和长期反应)。从历史上看, 这些过程被用光谱的角度描述为叶绿素荧光的变化, 光谱仍然是监测光合参数的重要方法。可以可视化潜在蛋白质复杂动力学的方法有限。在这里, 我们描述了一种快速和简单的方法, 高分辨率分离和可视化类样体复合物, 本地绿色凝胶电泳。该方法与时间相关的单光子计数相结合, 详细描述了在绿色凝胶上分离的带的叶绿素荧光特性。
Introduction
光合生物必须不断调整其生理特性, 以适应不断变化的环境条件, 最大限度地提高其生产力, 并成功地与邻居竞争1。负责光合作用光反应的机械尤其如此, 因为环境光条件在阴影和充分阳光之间可能会波动三个数量级。此外, 干旱、寒冷或热应激等环境因素会减少用于固碳的二氧化碳的供应, 而碳固定是光反应产物的天然电子汇。因此, 植物必须尽可能高效地收获和利用太阳辐射, 同时保持必要时耗散多余光能的能力。虽然光氧化损伤仍然经常发生在所有光线条件下2,3, 未能成功地管理吸收激发能量可能导致灾难性的细胞损伤和死亡。存在几种适应机制, 使光合装置既能适应当前环境条件的变化, 又能适应瞬态波动 (即长时间和短时间内的波动)4。其中包括长期反应 (ltr) 和非光化学淬火 (npq)。npq 本身被认为包含至少三个其他成分现象, 包括状态跃迁 (qt)、快速诱导能量淬火 (qT) 和光抑制 (qi)5。
这些过程最初是在光谱现象的角度观察和定义的 [例如, npq 指的是观察到的叶绿素荧光 (叶绿素荧光淬火) 的下降, 这不是由于增长率的增加。光化学]6。术语 “状态转换” 同样指的是从 psi 和 psii7观察到的荧光相对量的变化。虽然光谱技术使这些现象的枚举成为可能 [特别是脉冲调幅 (pam) 荧光光谱], 并继续是观察和剖析光合过程的重要手段在体内, 需要大量的生物化学来阐明这些光谱观测的机制。例如, 状态转变涉及由 stn7 激酶和 TAP38/PPH1 磷酸酶 (分别为 8、9、10) 对 lhcii 蛋白进行磷酸化/磷酸化循环。这个周期通过将 lhcii 三元组的一部分从 psii 移动到 psi, 从而改变光系统 11, 12 的吸收截面, 调整两个光系统之间的物理分布.npq 的 qe 组分通过紫菜的作用, 通过紫菜素/西沙/环氧循环和 psbs 蛋白的作用, 迅速将多余的激发能量转化为热量。psbs 在这一过程中的确切作用仍未完全了解 13。npq 的 qi 成分, 光抑制, 一般归因于对 psii 的 d1 蛋白的损害。恢复完全的光合能力需要一个复杂的修复过程来修复损坏的 psii 光合仪。psii 修复周期包括 psii 复合物从粮库中迁移、拆除复合物、更换受损的 d1 蛋白、重新组装 psii 复合物以及将 psii 复合物运回宏伟的堆栈 14.光抑制和 psii 光污染的确切性质仍然是一个严格审查的主题.
研究状态转换或 psii 修复等现象的困难, 部分原因是没有一种简单的方法来可视化复杂生化系统的力学。理解一个过程的经典生化方法是首先分离其组成部分, 以便能够孤立地描述它们。本地凝胶电泳产生于20世纪80年代的成功努力, 用更多的制备方法 (即蔗糖梯度离心和色谱法)分离和表征类囊体膜中的光系统复合物。为从类囊体膜中轻轻溶解原生复合物而开发的洗涤剂系统很快就适应了电泳分离方法, 最引人注目的是艾伦和施特赫林17号以及彼得和索伯18, 从而产生了原生绿色凝胶电泳。虽然在实验库中只代表了各种技术中的一种, 但原生 page 具有许多吸引人的特性, 使其成为光合作用研究中广泛使用的方法。原生 page 速度相对较快、简单, 只需很少的专用设备, 同时还能同时对大量类囊体进行高分辨率分离。这使得原生 page 成为研究类样体动力学的便捷工具, 并且, 当与第二维的标准 page 以及各种洗涤剂和缓冲系统结合使用时, 这是一个用于查找和表征新的类囊样复合物的多功能系统。
话虽如此, 土生土长的绿胶已经有了一个不可靠的技术的声誉, 特别是在经验不足的手中, 因为它很容易产生糟糕的结果, 包括模糊, 涂抹凝胶与很少的波段。这个问题在一定程度上被解决了与蓝色原生页19的介绍。在 bn 缓冲系统中使用共体染料, 使蛋白质分离更加稳健。因此, bn-page 通常是相对新手建立的一种更容易、更可靠的技术, 可以提供高分辨率的类囊样复合物分离。由于这些原因, bn-page 已成为这一领域大多数工作的首选方法。虽然 bn-page 的运行速度通常比绿色凝胶电泳慢, 但其主要缺点是, 同轴染料染色干扰了对含有叶绿素的微弱带的识别, 同时也使下游光谱表征有问题。
将原生凝胶和 2d sds-page 提供的生化信息与光谱技术的数据相结合, 可以得到极大的加强。无论使用哪种系统, 使用原生凝胶来识别复合物的一个核心问题是, 识别总是可以受到挑战 (即,在带中发现的蛋白质总是可以代表组合物或成分, 而不是比单一的生理正宗的复合)。光谱特性提供了有关绿色凝胶带中的颜料的生物物理信息, 并可用于确定它们可能含有哪些类型的复合物。叶绿素荧光在这方面特别有用, 因为不同光合色素蛋白复合物的光谱和荧光寿命往往有很大的不同。虽然简单的稳态77k 荧光光谱历来可用于确认原生凝胶复合物的身份, 但现代时间相关单光子计数 (tcspc) 可以提供更多的信息。tcspc 不仅可以根据荧光寿命对配合物进行表征, 还可以详细描述复合物中光谱成分之间的能量传递。随着各种原生凝胶体系的使用和新的假定复合物的发现, 这种特性变得越来越有必要, 从而能够更好地鉴定蛋白质复合物, 并提供新的关于这些综合体如何工作的生物物理信息。
在本文中, 我们提供了一种方法, 使那些很少或没有本地凝胶电泳经验的人, 以实现高质量的分辨率的原生类囊状配合物, 目的是研究光反应的力学光合作用。然后, 实验者可以酌情补充这一基本技术, 以提高结果或将适用性扩大到其他物种。然后, 我们描述了将原生绿色凝胶带置于 tcspc 之下的过程, 以及对该技术提供的数据进行基本分析和表示的一些步骤。本机凝胶电泳与 tcspc 分析的耦合, 通过提供对波段内蛋白质复合物的认证和生物物理表征, 扩展了这些凝胶系统的效用。这里描述的绿色凝胶系统是基于艾伦和施特赫林17开发的, 经过一些修改, 与施瓦茨等人使用的系统相同。20. 这一制度是许多系统之一, 但具有对这一方法有用的具体特点。它的速度足够快, 可以在一天内进行类样体分离、凝胶电泳和 tcspc 分析方便, 避免了样品储存和降解的潜在问题。我们还发现, 这种方法在经验不足的用户手中是稳健的, 同时仍然提供从好到优越的结果, 这取决于优化的程度。
重要的是要记住, 在原生凝胶上可视化的复合物取决于所使用的洗涤剂和缓冲液系统, 以及被调查的生物体的生物学。不同的洗涤剂和缓冲系统优先分离不同种类的配合物, 特定的光合生物将有不同的复合物从其他有机体, 并且不是所有在任何特定情况下都会存在。这里描述的系统特别适合于研究 psi 巨细胞, 如 schwarz等人所述。20, 但对于那些研究 psii 巨型巨细胞的人来说, 它落在了更不稳定的光谱端。为了全面研究用于囊样蛋白原生凝胶电泳的各种洗涤剂和缓冲液系统, 建议对 järvi等人进行综述。21和 rantala等人22岁
Protocol
Representative Results
Discussion
成功的类囊样增溶和本地凝胶运行将导致在凝胶上的多个明显可见的绿色带的分辨率, 而不会明显变形或涂抹的带。超载凝胶, 高洗涤剂浓度, 不正确的样品 ph 值, 未溶解的材料, 运行凝胶过快或在过高的温度, 和不适当的浇注凝胶, 都可能导致不良的类囊样配合物。在优化凝胶本身的条件 (例如, 丙烯酰胺梯度浓度) 的同时, 它可以帮助最大限度地解决感兴趣的波段。我们的经验是, 增溶条件和…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
密歇根州立大学化学系提供了资金和支助。
Materials
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Tris base | Sigma | #648310 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Decyl Maltoside | Sigma | D7658 | n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside |
| Octyl Glucoside | Sigma | O8001 | |
| Acrylamide | BioRad | 161-0148 | 37.5/1 C 40% solution |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| Ammonium Persulfate | BioRad | 161-0700 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 |
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