Séparation des épinards thylakoïdes Complexes des protéines par électrophorèse de Gel vert natif et caractérisation de bande en utilisant le comptage de Photon unique Time-Correlated

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à séparer les thylakoïdes solubilisée complexes par électrophorèse sur Gel natif de vert. Gel vert bandes sont caractérisés par la suite par temps en corrélation unique Photon Counting (TCSPC) et les étapes de base pour l’analyse de données sont fournis.

Abstract

Les réactions de la lumière de la photosynthèse sont effectuées par une série de complexes de protéine pigmentée dans les membranes des thylakoïdes. La stoechiométrie et l’organisation de ces complexes est très dynamique sur long et des échelles de temps courtes en raison de processus qui s’adaptent à la photosynthèse à l’évolution des conditions environnementales (c.-à-d. non photochimique trempe, les transitions d’État et le réponse à long terme). Historiquement, ces processus ont été décrits par spectroscopie en fonction des changements dans la fluorescence de la chlorophylle, et spectroscopie reste une méthode indispensable pour la surveillance des paramètres photosynthétiques. Il y a un nombre limité de façons dont la dynamique complexe de protéine sous-jacentes peut être visualisée. Nous décrivons ici une méthode simple et rapide pour la séparation à haute résolution et la visualisation des thylakoïdes complexes, électrophorèse sur gel vert natif. Cette méthode est couplée avec le temps-corrélé de photon unique comptant pour une caractérisation détaillée des propriétés de fluorescence de la chlorophylle de bandes séparées sur le gel vert.

Introduction

Les organismes photosynthétiques doivent ajuster en permanence leur physiologie à l’évolution des conditions environnementales afin de maximiser leur productivité et soutenir la concurrence avec les voisins de¹. Ceci est particulièrement vrai pour le mécanisme responsable des lumière des réactions de photosynthèse, comme la lumière ambiante conditions peuvent fluctuer de trois ordres de grandeur entre les ombres et plein soleil. En outre, les facteurs environnementaux tels que la sécheresse, froid ou de chaleur peuvent réduire la disponibilité de dioxyde de carbone pour la fixation du carbone, qui est l’évier électron naturelle pour les produits des réactions lumière. Plantes doivent, par conséquent, récolter et utiliser le rayonnement solaire aussi efficacement que possible tout en conservant la capacité de dissiper le surplus d’énergie lumineuse que nécessaire. Tandis que photooxidative dommages se produisent encore régulièrement au titre de l’ensemble de conditions de lumière^2,3, incapacité à gérer les énergie d’excitation absorbé avec succès peut conduire à la lésion des cellules catastrophique et la mort. Plusieurs mécanismes d’adaptation existent qui permettent à l’appareil photosynthétique à accorder aux changements de conditions d’environnement, tant à des fluctuations transitoires (p. ex., sur des échelles de temps longues et courtes)⁴. Il s’agit de la réponse à long terme (LTR) et non photochimique trempe (QNP). QNP est lui-même considéré comme pour englober au moins trois autres phénomènes de composant, y compris les transitions d’État (qT), trempe rapidement inductible de l’énergie (qE) et photoinhibition (qI)⁵.

Ces processus ont été initialement observés et définis en grande partie en termes de phénomènes spectroscopiques [p. ex. QNP se réfère à une goutte d’eau dans la fluorescence de la chlorophylle observés (extinction de fluorescence de la chlorophylle) qui n’est pas due à une augmentation du taux de photochimie]⁶. « Les transitions d’état » de la même façon on entend le changement observé dans la quantité relative de la fluorescence du PSI et PSII⁷. Alors que les techniques spectroscopiques qui ont fait l’énumération de ces phénomènes possible [en particulier, la spectroscopie de fluorescence (PAM) modulation d’amplitude d’impulsion] et continuent d’être un moyen vital d’observation et dissection photosynthétiques processus dans Vivo, beaucoup de biochimie est nécessaire afin d’élucider les mécanismes qui sous-tendent ces observations spectroscopiques. Transitions de l’États, par exemple, implique un cycle de phosphorylation/déphosphorylation des protéines LHCII par la protéine kinase STN7 et TAP38/PPH1 phosphatase, respectivement^8,9,10. Ce programme permet de régler la distribution physique de l’antenne LHCII entre les deux photosystèmes en déplaçant une partie des trimères LHCII de PSII au PSI, modifiant ainsi l’absorption coupe transversale des photosystèmes^11,12. Le composant qE de QNP se transforme rapidement en énergie d’excitation excessive en chaleur par l’intermédiaire de l’action de la violaxanthine/zéaxanthine époxydation/de-époxydation cycle et la protéine de l’OSP. Le rôle exact des organes subsidiaires principaux dans ce processus, c’est pas encore pleinement compris¹³. Le composant de qI de QNP, photoinhibition, est généralement attribué aux dommages à la protéine D1 du PSII. Restauration de compétence pleine photosynthèse nécessite un processus de réparation complexe pour résoudre endommagé photocenters PSII. Le cycle de réparation PSII implique la migration des complexes PSII hors les piles contiennent, démantèlement des complexes, remplacement des protéines endommagées de D1, remontage des complexes PSII et mouvement des complexes PSII dans les piles contiennent¹⁴. La nature exacte de la photoinhibition et PSII photovieillissement reste un objet d’un examen minutieux,¹⁵.

Les transitions de la difficulté à étudier des phénomènes comme l’état ou la réparation PSII découle en partie du fait qu’il n’y a pas un moyen simple de visualiser la mécanique des systèmes biochimiques complexes. L’approche biochimique classique pour comprendre un processus consiste à séparer ses composants afin qu’ils peuvent être caractérisés en vase clos. Électrophorèse sur gel natif découle d’efforts couronnés de succès dans les années 1980 à séparer et à caractériser les complexes de photosystème des membranes thylakoïdes avec plusieurs méthodes préparatives (centrifugation en gradient de saccharose et chromatographie)¹⁶. Les détergents systèmes développés pour solubiliser doucement les complexes natives des membranes thylakoïdes étaient bientôt adaptés aux méthodes de séparation par électrophorèse, plus particulièrement par Allen et Staehelin¹⁷ et et Peter et Thornber¹⁸, donnant lieu électrophorèse sur gel vert natif. Alors que le seul représentant de diverses techniques dans l’arsenal expérimentale, natif de PAGE a un certain nombre de caractéristiques attrayantes qui en ont fait une méthode couramment employée dans la recherche de la photosynthèse. PAGE native est relativement rapide et simple, nécessitant des équipements peu spécialisés, tout en assurant simultanément la séparation de haute résolution d’un grand nombre de complexes de thylakoïdes. Cela rend PAGE native, un outil pratique pour l’étude dynamique des thylakoïdes et, lorsqu’il est combiné avec une PAGE standard dans la deuxième dimension, mais aussi une variété de systèmes de détergent et de la mémoire tampon, un système polyvalent pour la trouver et la caractérisation de nouveaux complexes de thylakoïdes.

Cela étant dit, gels verts natifs ont eu la réputation d’être une technique peu fiable, en particulier dans des mains inexpérimentées, tel qu’il est facile de produire des résultats médiocres, consistant en des gels floues, graisseux avec peu de bandes. Ce problème a été résolu, en partie, avec l’introduction de bleu-indigène PAGE¹⁹. L’utilisation de colorant coommassie dans le système de tampon ne rend la séparation de protéines plus robustes. Par conséquent, BN-PAGE est souvent une technique plus facile et plus fiable pour un novice relative à mettre en place et peut fournir des séparations de haute résolution de thylakoïdes complexes. Pour ces raisons, BN-PAGE est devenu la méthode de choix pour la plupart des travaux de ce champ. BN-PAGE est généralement plus lente à gérer que l’électrophorèse sur gel vert, son inconvénient principal est que la coloration coommassie interfère avec l’identification de faibles bandes contenant de la chlorophylle, tout en s’en aval spectroscopiques caractérisation de problématique.

L’information biochimique fournie par gels natifs et SDS-PAGE 2D peut être considérablement renforcée lorsqu’il est combiné avec les données techniques spectroscopiques. Quel que soit le système utilisé, un problème central avec l’aide de gels natifs pour identifier des complexes est que l’identification peut toujours être contestée (c’est-à-dire, les protéines trouvées dans une bande pourrait toujours représenter complexes migrent ou composants, plutôt qu’un seul complexe physiologiquement authentique). Caractérisation spectroscopique fournit des informations biophysiques sur les pigments dans les bandes de gel vert et peut être utilisée pour déterminer quels types de complexes, elles sont susceptibles de contenir. Fluorescence de la chlorophylle est particulièrement utile à cet égard en raison de la souvent radicalement différents spectres et les durées de vie de fluorescence qui sont caractéristiques des complexes protéiques-pigment photosynthétique. Alors que les spectres de fluorescence simple équilibre 77K ont été historiquement utiles pour confirmer l’identité des complexes de gel natif, moderne temps-corrélé de photon unique comptant (TCSPC) peut fournir beaucoup plus d’informations. TCSPC permet non seulement de la caractérisation des complexes basées sur des durées de vie de fluorescence, mais rend aussi possible la description détaillée du transfert d’énergie entre les composantes spectrales au sein d’un complexe. Ce genre de caractérisation devient de plus en plus nécessaire que l’utilisation des différents systèmes “spreads” de gel natif et nouveaux complexes putatifs sont découverts, permettant l’identification des complexes de protéines doivent être mieux authentifiées et offrant de nouvelles données biophysiques sur le fonctionnement de ces complexes.

Dans cet article, nous fournissons une méthode qui permet à ceux ayant peu ou pas d’expérience avec électrophorèse native de parvenir haute qualité de thylakoïdes native complexes aux fins de l’enquête sur les mécanismes des réactions de lumière photosynthèse. Cette technique de base peut ensuite être augmentée à la discrétion de l’expérimentateur pour améliorer les résultats ou étendre l’applicabilité à d’autres espèces. Nous décrivons ensuite le processus pour soumettre les bandes de gel vert natif à TCSPC, ainsi que quelques étapes de base analyse et présentation des données fournies par la technique. Le couplage de l’électrophorèse sur gel natif avec analyse TCSPC étend l’utilité de ces systèmes de gel en fournissant l’authentification et la caractérisation biophysique des complexes protéiques dans les bandes. Le système de gel vert décrit ici repose sur développé par Allen et Staehelin¹⁷ avec quelques modifications, qui est le même que celui utilisé dans Schwarz et coll.. ²⁰. ce système est un des nombreux mais a des spécificités qui sont utiles pour cette méthode. C’est assez rapide pour que l’isolement des thylakoïdes, électrophorèse sur gel et TCSPC analyse pratique peuvent être effectuées en une seule journée, il ne soit pas des problèmes potentiels de conservation de l’échantillon et de la dégradation. Nous constatons également que cette méthode est robuste dans les mains des utilisateurs inexpérimentés, tout en offrant des résultats qui vont du bon au supérieur, selon le degré d’optimisation.

Il est important de garder à l’esprit que les complexes visualisées sur un gel natif dépendant sur le détergent et le tampon des systèmes utilisés, ainsi que sur la biologie de l’organisme incriminé. Différents systèmes de détergent et tampon préférentiellement séparent différents types de complexes, et un organisme photosynthétique donné auront différents complexes provenant d’autres organismes, pas ce qui se présentera sous aucune circonstance donnée. Le système décrit ici est particulièrement adapté à l’étude des megacomplexes PSI, comme décrit dans Schwarz et al. ²⁰, mais il tombe sur la fin plus déstabilisante du spectre pour ceux qui étudient la PSII megacomplexes. Pour une étude approfondie des différents systèmes de détergent et de la mémoire tampon utilisée en électrophorèse native des protéines des thylakoïdes, il est recommandé de revoir Järvi et al. ²¹ et Rantala et al. ²².

Protocol

1. préparation de Solutions stock pour le coulage des Gels natifs de vert Préparer un 4 x solution de tampon concentré pour résoudre les gels composé de 40 % de glycérol, glycine de 200 mM et 100 mM Tris tamponnée à pH 8,3. Préparer un 4 x solution de tampon concentré pour empilage gels composé de 40 % de glycérol, glycine de 200 mM et 100 mM Tris tamponnée à pH 6,3. Stocker ces tampons à 4 ° C pour empêcher la croissance de moisissures.Remarque : Les tampons sont stabl…

Representative Results

Les résultats représentatifs pour l’électrophorèse de gel vert sont présentés dans la Figure 1. Lane 1 fournit un exemple des résultats idéaux pour l’électrophorèse de gel vert des épinards thylakoïdes, dans lequel un nombre maximal de bandes vertes claires et nettes est visible. Ces résultats sont quelque peu atypiques, en partie parce que pas toutes les bandes vus en piste 1 sont normalement présents dans un échantillon donné. Nettoyage …

Discussion

Une solubilisation de thylakoïdes réussie et le gel natif exécuter seront traduira par la résolution de plusieurs bandes distinctes de verts visibles sur le gel sans distorsion importante ou bavures des bandes. Surcharge le gel, une forte concentration de détergent, un pH de l’échantillon incorrect, non dissous matériel, tourne le gel trop rapidement ou à une température trop élevée, et un gel mal coulé sont autant de facteurs qui peut-être contribuer aux complexes de thylakoïdes mal résolus. Tout en opt…

Materials

Glycine	Sigma	G8898
Tris base	Sigma	#648310
SDS	Sigma	L3771
Decyl Maltoside	Sigma	D7658	n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside
Octyl Glucoside	Sigma	O8001
Acrylamide	BioRad	161-0148	37.5/1 C 40% solution
TEMED	BioRad	161-0800
Ammonium Persulfate	BioRad	161-0700
Magnesium Chloride	Sigma	M2670
Potassium Chloride	Sigma	P9333