Ispanak Thylakoid Protein kompleksleri yerli yeşil Jel Elektroforez ve grup Time-Correlated tek foton sayma kullanarak karakterizasyonu tarafından ayrılması
Summary
Burada çözündürüldükten thylakoid kompleksleri tarafından yerel Yeşil Jel Elektroforez ayırmak için bir iletişim kuralı mevcut. Yeşil Jel bantları daha sonra zaman korelasyon tek foton sayma (TCSPC tarafından) karakterizedir ve veri analizi için temel adımlar sağlanır.
Abstract
Fotosentez ışık reaksiyonları thylakoid membranlarda pigmentli protein kompleksleri bir dizi tarafından yapılmaktadır. Stoichiometry ve bu komplekslerin organizasyon son derece dinamik hem uzun hem de kısa süre ölçekler fotosentez için değişen çevre koşullarına uyum süreçleri nedeniyle (Yani, fotokimyasal sigara Şoklama, durum geçişlerini ve uzun vadeli yanıt). Tarihsel olarak, bu işlemler spectroscopically değişiklikler açısından Klorofil Floresans tarif edilmistir ve Spektroskopi fotosentetik parametreleri izlemek için hayati bir yöntem kalır. Sınırlı birkaç temel protein karmaşık dinamiklerini görüntülenmeyecektir yolu vardır. Burada yüksek çözünürlüklü ayrılık ve thylakoid kompleksleri, yerel Yeşil Jel Elektroforez görselleştirme için hızlı ve basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem tek foton ilişkili süre bantları üzerinde yeşil jel ayrılmış Klorofil Floresans özelliklerini detaylı karakterizasyonu için sayma ile birleştirilmiştir.
Introduction
Fotosentetik canlılar sürekli değişen çevre koşullarına verimliliği maksimize etmek ve başarıyla komşular1ile rekabet için onların Fizyoloji ayarlamanız gerekir. Bu makine ortam ışığı koşulları tarafından üç büyüklük gölgeler ve tam güneş ışığı altında arasında dalgalanma olarak fotosentez, ışık reaksiyonları için sorumlu özellikle doğrudur. Ayrıca, kuraklık, soğuk veya sıcak stres gibi çevresel faktörler karbon dioksit doğal elektron lavabom ışık reaksiyonları ürünler için karbon fiksasyonu için kullanılabilirliğini azaltabilir. Bitki gerekir, bu nedenle, hasat ve güneş radyasyonu gerektiği gibi aşırı ışık enerjisini dağıtmak yeteneği koruyarak mümkün olduğunca verimli bir şekilde kullanmak. Photooxidative hasar hala düzenli olarak tüm ışık koşullarında2altında,3, başarısızlık yönetmek için absorbe uyarma enerji başarıyla felaket hücre hasarı ve ölüme yol açabilir sırasında oluşur. Birkaç adaptif mekanizmaların hakim çevre koşulları değişiklikler ve geçici dalgalanmalar (Yani, kısa ve uzun timescales üzerinden)4şekilde ayarlanmış fotosentetik aparatı izin yok. Bu uzun vadeli yanıt (soldan sağa) ve olmayan fotokimyasal Şoklama (NPQ) içerir. NPQ kendisi durum geçişlerini (qT), hızla indüklenebilir enerji su verme (qE) ve photoinhibition (qI)5de dahil olmak üzere en az üç bileşen olayları kapsayacak şekilde kabul olduğunu.
Bu işlemler aslında gözlenen ve büyük ölçüde spektroskopik olayları açısından tanımlanan [Örneğin, NPQ anlamına gelir bir damla oranı artış nedeniyle değil (Klorofil Floresans Şoklama) gözlenen Klorofil Floresans içinde photochemistry]6. “Durum geçişlerini” benzer şekilde gözlenen için bir terimdir floresans PSI ve PSII7göreli miktarını değiştirin. Süre bu olayların numaralandırma mümkün kılmıştır spektroskopik teknikleri [özellikle, darbe genlik modülasyonlu (PAM) floresans spektroskopisi] ve gözlemleyerek ve fotosentetik süreçleri içinde dissekan için hayati bir araç olmaya devam Vivo, büyük bir biyokimya spektroskopik bu gözlemler temel mekanizmaları aydınlatmak için gereklidir. Devlet geçişler, örneğin, LHCII protein fosforilasyon/dephosphorylation döngüsünü STN7 kinaz ve TAP38/PPH1 fosfataz, sırasıyla8,9,10içerir. Bu döngü LHCII anten hareket ettirerek LHCII trimers bir bölümünü PSII böylece emme değiştirerek PSI için iki photosystems arasında fiziksel dağıtım ayarlar kesit photosystems11,12. NPQ qE bileşeni hızla ısı violaxanthin/zeaksantin epoxidation/de-epoxidation döngüsü ve PsbS protein eylemlerle aşırı uyarma enerji dönüştürür. Tam PsbS bu süreçte hareketsiz değil tam olarak13anlaşılmış roldür. NPQ, photoinhibition, qI bileşeni genellikle PSII D1 protein zarar atfedilir. Restorasyon tam fotosentetik yeterlilik bozuk PSII photocenters düzeltmek için bir ayrıntılı onarım işlemi gerektirir. PSII onarım döngüsü PSII kompleksleri granal yığınları, kompleksleri sökülmesi, değişimi hasarlı D1 proteinlerin, yeniden birleştirilmesinden PSII kompleksleri ve PSII kompleksleri hareketi granal yığınları14içine geri dışarı geçiş içerir. Photoinhibition ve PSII duyarlilik kesin yapısını bir konu yoğun İnceleme15kalır.
Olayları devlet gibi eğitim zorluk geçişler veya PSII onarım kısmen karmaşık biyokimyasal sistemlerin mekaniği görselleştirmek için bir basit yolu olduğu gerçeğini doğar. Bir süreci anlamak için klasik biyokimyasal yaklaşım onlar yalıtım modunda karakterize edilebilir böylece önce bileşenlerinin ayırmaktır. Yerel jel elektroforez başarılı çalışmalar ayrı ve thylakoid membran ile daha fazla partiye hazırlık Yöntemleri (yani sükroz degrade Santrifüjü ve Kromatografi)16üzerinden photosystem kompleksleri karakterize 1980’lerde ortaya çıktı. Yavaşça solubilize thylakoid membran üzerinden yerel kompleksleri için geliştirilen deterjan sistemleri yakında en önemlisi Allen ve Staehelin17 tarafından elektroforetik ayrımı yöntemleri için uyarlandı ve ve sebebiyet veren Peter ve Thornber18, yerli yeşil Jel Elektroforez için. Çeşitli teknikler deneysel cephanelik, yerel sayfa dışında temsil eden tek kişi fotosentez araştırmalarda yaygın olarak çalışan bir yöntem yapmış çekici özellikleri bir dizi varken. Yerel sayfa nispeten hızlı ve basit, aynı anda çok sayıda thylakoid kompleksleri ayrılması yüksek çözünürlüklü sağlarken küçük özel ekipman gerektiren. Bu uygun bir araç için thylakoid dynamics eğitimi ve, ikinci boyutu yanı sıra bulmak ve yeni thylakoid kompleksleri karakterize için çok yönlü bir sistem deterjan ve tampon sistemleri, çeşitli standart sayfa ile birlikte ne zaman yerel sayfa yapar.
Gibi belirsiz, smeary jeller kaç şeritli oluşan kötü sonuçlar üretmek kolay olduğu söyleniyor, güvenilmez bir tekniği, özellikle de deneyimsiz ellerde olduğun için bir itibar yerli yeşil jelleri oldu. Bu sorunu, kısmen, mavi-yerli sayfa19giriş ile çözüldü. BN tampon sistemi coommassie boya kullanımı protein ayrımı daha sağlam yapar. Bu nedenle, BN-sayfa kez kurmak göreli bir acemi için daha kolay ve daha güvenilir bir teknik ve yüksek çözünürlüklü ayrımları thylakoid kompleksleri, sağlayabilir. Bu nedenlerden dolayı BN SAYFALIK bu alanın çoğu iş için seçim yöntemi haline gelmiştir. BN-sayfa çalıştırmak Yeşil Jel Elektroforez, onun büyük dezavantajı olduğunu genellikle daha yavaş olmakla birlikte coommassie boya boyama aşağı akım yaparken aynı zamanda zayıf bantları, klorofil içeren tanımlaması engelleyen spektroskopik karakterizasyonu sorunlu.
Biyokimyasal bilgilerini yerel jelleri tarafından sağlanan ve 2D SDS-sayfa büyük ölçüde spektroskopik teknikleri verilerle birleştirildiğinde güçlendirilmiş. İstihdam ne olursa olsun, konut projeleri belirlemek için yerel jeller kullanarak merkezi bir sorun kimliği her zaman meydan okunabilir sistemidir (proteinler bir grupta bulunduYani, her zaman temsil comigrating kompleksleri veya bileşenleri, daha doğrusu tek fizyolojik otantik karmaşık bir). Spektroskopik karakterizasyonu yeşil jel bantlarında pigmentler biyofiziksel Kılavuzu ve konut projeleri ne tür onlar bulunma olasılığı olduğunu belirlemek için kullanılır. Klorofil Floresans bu konuda sık sık önemli ölçüde farklı spectra ve farklı fotosentetik pigment-protein kompleksleri karakteristik floresans ömürleri nedeniyle özellikle yararlıdır. Ise basit kararlı durum 77 K floresans spectra tarihsel olarak yerli jel kompleksleri kimliklerini doğrulayan yararlı olabilirdi, (TCSPC) sayma modern ilişkili süre tek foton çok daha fazla bilgi sağlayabilir. TCSPC sadece floresan ömürleri üzerinde dayalı kompleksleri karakterizasyonu verir, ancak aynı zamanda enerji transferi bir kompleksi içinde spektral bileşenler arasındaki ayrıntılı açıklaması mümkün kılar. Bu tür bir karakterizasyonu olarak çeşitli yerel jel sistemleri yayılır kullanımı giderek gerekli hale geliyor ve daha iyi doğrulanması için protein kompleksleri tanımlamasını sağlayan ve yeni sağlayan yeni sözde kompleksleri keşfedilir Bu komplekslerin nasıl çalıştığı hakkında biyofiziksel bilgi.
Bu yazıda biz bu ışık reaksiyonları mekaniği araştırılması amacıyla yerel thylakoid kompleksleri, yüksek nitelik kararlılık elde etmek için yerel jel elektroforez ile az veya hiç deneyimi olan sağlayan bir yöntem sağlar fotosentez. Bu temel teknik sonra sonuçları geliştirmek veya diğer türler için uygulanabilirlik genişletmek için deneyci’nın takdirine artar olabilir. O zaman TCSPC, temel analiz ve teknik tarafından sağlanan verilerin sunumunu için bazı adımlar olarak yerli yeşil jel bantları tutulmasi için işlemi açıklar. Yerel jel elektroforez TCSPC analizi ile bağlantı yardımcı programı bu jel sistemlerinin protein kompleksleri bantları içindeki malzemelerin kimlik doğrulaması ve biyofiziksel sağlayarak genişletir. Burada açıklanan yeşil jel sistemi Allen ve Staehelin17 bazı değişikliklerle tarafından geliştirilen ve Schwarz ve arkiçinde kullanılan ile aynı temel alır. 20. bu sistem birçok biridir ancak için bu yöntem yararlıdır belirli özelliklere sahiptir. Thylakoid yalıtım, Jel Elektroforez ve TCSPC Analizi uygun bir günde, olası sorunları örnek depolama ve yıkımı obviating yapılabilir böylece yeterince hızlı. Biz de bu yöntem sonuçları arasında iyi üstün, en iyi duruma getirme derecesine bağlı olarak değişen sağlarken deneyimsiz kullanıcılar, elinde sağlam olduğunu bulmak.
Kullanılan deterjan ve arabellek sistemlerinin yanı sıra soruşturma altında organizma biyolojisi üzerinde yerel bir jel görselleştirildiği kompleksleri bağlı akılda tutulması önemlidir. Farklı deterjan ve tampon sistemleri tercihen kompleksler farklı türde ayırın ve belirli bir fotosentetik organizma farklı kompleksleri gelen tüm bunların altında verilen herhangi bir durum mevcut olacaktır diğer organizmalar olacaktır. Burada açıklanan sistem Schwarz ve arkiçinde açıklandığı gibi özellikle PSI megacomplexes, çalışma için uygundur. 20, ama düşüyor spektrumunun daha destabilizing ucunda PSII megacomplexes eğitim görenler için. Çeşitli deterjan ve tampon sistemleri yerli jel elektroforez thylakoid proteinlerin içinde kullanılan kapsamlı bir çalışma için bu göl ve arkincelemek için tavsiye edilir. 21 ve Rantala vd. 22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Başarılı thylakoid solubilization ve yerel jel çalıştırmak birden çok farklı görünür yeşil bantlar üzerinde önemli bozulma olmadan jel çözümlenmesi veya grupları bulaşması neden olur. Jel aşırı yüksek bir deterjan konsantrasyon, bir yanlış örnek pH çok hızlı veya çok yüksek bir ısıda, jel çalıştıran malzeme, undissolved ve uygun olmayan şekilde döktü bir jel kötü çözülmüş thylakoid kompleksleri için katkıda bulunabilir tüm faktörler vardır. Jel kendisi şartları en i…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansman ve destek Michigan Eyalet Üniversitesi’nde kimya bölümü tarafından verilmiştir.
Materials
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Tris base | Sigma | #648310 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Decyl Maltoside | Sigma | D7658 | n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside |
| Octyl Glucoside | Sigma | O8001 | |
| Acrylamide | BioRad | 161-0148 | 37.5/1 C 40% solution |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| Ammonium Persulfate | BioRad | 161-0700 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 |
Referenzen
- Yamori, W. Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress. Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).
- Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions). Plant Physiology. 103 (1), 181-189 (1993).
- Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. M. Turnover of the photosystem II D1 protein in higher plants under photoinhibitory and nonphotoinhibitory irradiance. Journal of Biological Chemistry. 268 (34), 25476-25482 (1993).
- Dietze, l. L., Bräutigam, K., Pfannschmidt, T. Photosynthetic acclimation: state transitions and adjustment of photosystem stoichiometry-functional relationships between short-term and longterm light quality acclimation in plants. FEBS Journal. 275 (6), 1080-1088 (2008).
- Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. Regulation of light harvesting in green plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 655-684 (1996).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology. 59, 89-113 (2008).
- Williams, W. P. Spatial organization and interaction of the two photosystems in photosynthesis. Nature. 225 (5239), 1214-1217 (1970).
- Bellafiore, S., Barneche, F., Peltier, G., Rochaix, J. D. State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7. Nature. 433 (7028), 892-895 (2005).
- Shapiguzov, A., et al. The PPH1 phosphatase is specifically involved in LHCII dephosphorylation and state transitions in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (10), 4782-4787 (2010).
- Pribil, M., Pesaresi, P., Hertle, A., Barbato, R., Leister, D. Role of plastid protein phosphatase TAP38 in LHCII dephosphorylation and thylakoid electron flow. Public Library of Science Biology. 8 (1), (2010).
- Larsson, U. K., Jergil, B., Andersson, B. Changes in the lateral distribution of the light-harvesting chlorophyll-a/b-protein complex induced by its phosphorylation. European Journal of Biochemistry. 136 (1), 25-29 (1983).
- Minagawa, J. State transitions–the molecular remodeling of photosynthetic supercomplexes that controls energy flow in the chloroplast. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (8), 897-905 (2011).
- Ruban, A. V. Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage. Plant Physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).
- Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 159-168 (2005).
- Li, L., Aro, E. M., Millar, A. H. Mechanisms of Photodamage and Protein Turnover in Photoinhibition. Trends in Plant Science. , (2018).
- Dunahay, T. G., Staehelin, L. A. Isolation of photosystem I complexes from octyl glucoside/sodium dodecyl sulfate solubilized spinach thylakoids: characterization and reconstitution into liposomes. Plant Physiology. 78 (3), 606-613 (1985).
- Allen, K. D., Staehelin, L. A. Resolution of 16 to 20 chlorophyllprotein complexes using a low ionic strength native green gel system. Analytical Biochemistry. 194 (1), 214-222 (1991).
- Peter, G. F., Thornber, J. P. Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (25), 16745-16754 (1991).
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
- Schwarz, E. M., Tietz, S., Froehlich, J. E. Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants. Photosynthesis Research. 136 (1), 107-124 (2018).
- Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439 (2), 207-214 (2011).
- Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92 (5), 951-962 (2017).
- Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).
