Separación de espinacas tilacoides complejos de proteínas por electroforesis en Gel verde nativo y caracterización de banda utilizando conteo de fotones solo Time-Correlated
Summary
Aquí presentamos un protocolo para separar complejos de tilacoides solubilizado por electroforesis nativa en verde. Bandas de gel verde posteriormente se caracterizan por tiempo correlacionó solo fotón contando (TCSPC) y pasos básicos para el análisis de los datos se proporcionan.
Abstract
Las reacciones de luz de la fotosíntesis se llevan a cabo por una serie de complejos de proteína pigmentada en las membranas tilacoides. La estequiometría y la organización de estos complejos es altamente dinámica en el largo y corto plazos debido a los procesos que se adaptan la fotosíntesis a las cambiantes condiciones ambientales (es decir, el amortiguamiento no fotoquímica, las transiciones de estado y la respuesta a largo plazo). Históricamente, estos procesos se han descrito espectroscópico en términos de cambios en la fluorescencia de la clorofila y espectroscopia sigue siendo un método esencial para el monitoreo de parámetros de fotosíntesis. Hay un número limitado de formas en que se puede visualizar la compleja dinámica de la proteína subyacente. Aquí describimos un método rápido y simple para la separación de alta resolución y visualización de complejos de tilacoides, electroforesis en gel verde nativo. Este método se combina con tiempo-correlacionada fotón contando para la caracterización detallada de las propiedades de fluorescencia de clorofila de bandas separadas en el gel verde.
Introduction
Organismos fotosintéticos constantemente deben ajustar su fisiología a las cambiantes condiciones ambientales para maximizar su productividad y competir con éxito con vecinos1. Esto es especialmente cierto de la maquinaria responsable de las reacciones de luz de la fotosíntesis, como luz ambiental condiciones pueden fluctuar por tres órdenes de magnitud entre las sombras y a plena luz del sol. Además, factores ambientales tales como sequía, frío o estrés por calor pueden reducir la disponibilidad de dióxido de carbono para la fijación de carbono, que es el fregadero del electrón natural para los productos de las reacciones de luz. Plantas deben, por lo tanto, cosechar y utilizar radiación solar tan eficientemente como sea posible sin perder la capacidad de disipar el exceso de energía luz según sea necesario. Mientras que photooxidative daño todavía ocurre rutinariamente bajo todas las condiciones de luz2,3, falta lograr excitación absorbe energía con éxito puede conducir al daño catastrófico celular y muerte. Varios mecanismos adaptativos existen que permiten que el aparato fotosintético a ajustarse a los cambios en las condiciones ambientales prevalecientes y a las fluctuaciones transitorias (es decir, en plazos cortos y largos)4. Estos incluyen la respuesta a largo plazo (LTR) y Temple no fotoquímica (NPQ). NPQ es en sí mismo considerado para abarcar por lo menos tres otros fenómenos de componente, incluyendo las transiciones de estado (qT), amortiguamiento de energía rápidamente inducible (qE) y fotoinhibición (qI)5.
Estos procesos fueron originalmente observados y define en gran medida en términos de fenómenos espectroscópicos [e.g., NPQ se refiere a una gota en observada fluorescencia (quenching de fluorescencia de la clorofila) que no es debido a un aumento en la tasa de fotoquímica]6. El término “las transiciones de estado” se refiere igualmente al cambio observado en la cantidad relativa de la fluorescencia de PSI y PSII7. Mientras que las técnicas espectroscópicas que han posibilitado la enumeración de estos fenómenos [en particular, la amplitud de pulso modulada de espectroscopia de fluorescencia (PAM)] y siguen siendo un medio vital para observar y diseccionar los procesos fotosintéticos en vivo, mucho de la bioquímica es necesaria para aclarar los mecanismos subyacentes a estas observaciones espectroscópicas. Transiciones de estado, por ejemplo, implica un ciclo de la fosforilación/desfosforilación de las proteínas LHCII por la STN7 cinasa y la fosfatasa TAP38/PPH1, respectivamente8,9,10. Este ciclo ajusta la distribución física de la antena LHCII entre los dos fotosistemas moviendo una porción de trimers LHCII de PSII a PSI, cambiando así la absorción de la sección transversal de los fotosistemas11,12. El componente FC de NPQ rápidamente convierte la energía de exceso de excitación en calor a través de las acciones del ciclo de epoxidación/de-epoxidación de violaxantina/zeaxantina y la proteína de subsidiarios. El papel exacto de subsidiarios en este proceso es aún no comprendido del todo13. El componente de qI de NPQ, fotoinhibición, generalmente se atribuye al daño a la proteína D1 del PSII. Restauración de competencia fotosintética total requiere un proceso de reparación elaborados para solucionar dañado PSII photocenters. El ciclo de reparación PSII implica la migración de complejos PSII de la pilas granal, desmantelamiento de los complejos, recambio de proteínas dañadas de la D1, rearmado de los complejos PSII y el movimiento de complejos PSII en el granal pilas14. La naturaleza exacta de la fotoinhibición y PSII fotodaño sigue siendo objeto de intenso escrutinio15.
La dificultad en el estudio de fenómenos como el estado de las transiciones o reparación PSII surge en parte del hecho de que hay no una forma simple de visualizar la mecánica de sistemas bioquímicos complejos. El enfoque clásico de la bioquímico para entender un proceso es primero separar sus componentes por lo que puede ser caracterizados en aislamiento. Electroforesis nativa surgieron de los esfuerzos exitosos en la década de 1980 para separar y caracterizar los complejos del fotosistema de los tilacoides con más métodos de preparación (es decir, centrifugación de gradiente de sacarosa y cromatografía)16. Los sistemas detergentes para solubilizar suavemente los conjuntos nativos de las membranas tilacoides pronto fueron adaptados a los métodos de separación electroforética, en particular por Allen y Staehelin17 y y Peter y Thornber18, dando lugar a electroforesis en gel verde nativo. Mientras que representan sólo uno de una variedad de técnicas en el arsenal experimental, página nativa tiene un número de características atractivas que han hecho un método ampliamente empleado en la investigación de la fotosíntesis. Página nativa es relativamente rápida y sencilla, requiriendo equipo poco especializado, ofreciendo al mismo tiempo la separación de alta resolución de un gran número de complejos de tilacoides. Esto hace que página nativa una herramienta conveniente para estudiar la dinámica de los tilacoides y, cuando se combina con la página estándar de la segunda dimensión, así como una variedad de sistemas de tampón y detergente, un versátil sistema para la búsqueda y caracterización de nuevos complejos de tilacoides.
Dicho esto, los geles verdes nativos han tenido una reputación de ser una técnica poco fiable, especialmente en manos inexpertas, ya que es fácil producir resultados pobres consisten en geles borrosos, graso con pocas bandas. Este problema fue solucionado, en parte, con la introducción del azul natural página19. El uso de tinte coommassie en el sistema BN hace separación de las proteínas más robusto. Por lo tanto, BN-página suele ser una técnica más fiable y más fácil para un novato relativa configurar y puede proporcionar separaciones de alta resolución de los complejos de tilacoides. Por estas razones, BN-PAGE se ha convertido en el método de elección para la mayoría de los trabajos de este campo. BN-PAGE es generalmente más lento correr de electroforesis en gel verde, su principal inconveniente es que la coloración de tinte de coommassie interfiere con la identificación de bandas débiles que contiene clorofila, además de hacer aguas abajo espectroscópicas Caracterización problemática.
La información bioquímica proporcionada por geles nativos y 2D SDS-PAGE puede fortalecerse enormemente cuando se combina con los datos de técnicas espectroscópicas. Independientemente del sistema empleado, un problema central con el uso de geles nativos para identificar complejos es que la identificación siempre puede ser impugnada (es decir, las proteínas se encuentran en una banda podría siempre representan complejos comigrating o componentes, sino de un solo complejo fisiológico auténtico). Caracterización espectroscópica proporciona información biofísica sobre los pigmentos en las bandas de gel verde y puede utilizarse para determinar qué tipo de complejos son capaces de contener. Fluorescencia de la clorofila es especialmente útil en este sentido debido a la a menudo dramáticamente diversos espectros y cursos de la vida de la fluorescencia que son característicos de complejos pigmento fotosintéticos diferentes proteínas. Mientras que los espectros de fluorescencia de estado estacionario simple 77K históricamente han sido útiles para confirmar las identidades de los complejos de gel nativo, moderno tiempo-correlacionada fotón contando (TCSPC) puede proporcionar mucha más información. TCSPC permite no sólo la caracterización de los complejos basados en cursos de la vida de la fluorescencia, pero también hace posible la descripción detallada de la transferencia de energía entre componentes espectrales dentro de un complejo. Este tipo de caracterización se está convirtiendo en cada vez más necesaria como el uso de varias extensiones de sistemas de gel nativo y se descubren nuevos supuestos complejos, permitiendo la identificación de complejos de la proteína para ser mejor autenticados y proporcionar nuevos información biofísica sobre el funcionamiento de estos complejos.
En este trabajo ofrecemos un método que permite a los que tienen poca o ninguna experiencia con electroforesis nativa para lograr alta calidad de resolución de los complejos de tilacoides nativo con el fin de investigar los mecanismos de las reacciones de luz de fotosíntesis. Esta técnica básica entonces se puede aumentar a criterio del experimentador para mejorar resultados o ampliar la aplicabilidad a otras especies. Luego Describimos el proceso para sujetar vendas de gel verde nativo TCSPC, así como algunos pasos para el análisis básico y presentación de los datos proporcionados por la técnica. El acoplamiento de electroforesis nativa con análisis TCSPC amplía la utilidad de estos sistemas de gel proporciona autenticación y caracterización biofísica de complejos de proteína dentro de las bandas. El sistema de gel verde descrito aquí se basa en que desarrollado por Allen y Staehelin17 con algunas modificaciones y es el mismo que el utilizado en Schwarz et al. 20. este sistema es uno de los muchos pero tiene características específicas que son útiles para esta metodología. Es lo suficientemente rápida para que aislamiento de tilacoides, electroforesis y análisis TCSPC conveniente se pueden realizar en un día, evitando posibles problemas de almacenamiento de la muestra y degradación. También encontramos que este método es robusto en las manos de usuarios inexpertos, sin dejar de ofrecer resultados que van de bueno a superior, dependiendo del grado de optimización.
Es importante tener en cuenta que los complejos visualizados en un gel nativo en el detergente y el buffer sistemas utilizados, así como sobre la biología del organismo bajo investigación. Diferentes sistemas de tampón y detergente preferentemente separan diferentes tipos de complejos, y un organismo fotosintético determinado tendrá diferentes complejos de otros organismos, no todos los cuales estarán presentes en cualquier circunstancia dada. El sistema descrito aquí es particularmente adecuado para el estudio de megacomplexes PSI, como se describe en Schwarz et al. 20, pero cae en el extremo más desestabilizador del espectro para quienes estudian megacomplexes PSII. Para un estudio exhaustivo de los diversos sistemas de tampón y detergente usados en electroforesis nativa de tilacoides proteínas, se recomienda revisar Järvi et al. 21 y Rantala et al. 22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un éxito tilacoides solubilización y gel nativo ejecutar resultará en la resolución de múltiples bandas verdes visibles distintas sobre el gel sin la distorsión significativa o mancharse de las bandas. Sobrecargar el gel, una alta concentración de detergente, un pH de muestra incorrecta, disuelta material, correr el gel a temperatura demasiado elevada o demasiado rápidamente y un gel incorrectamente vertido son factores que pueden contribuir a complejos de tilacoides mal resuelto. Y optimizar las condiciones del …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiación y apoyo fueron proporcionados por el Departamento de química de la Universidad Estatal de Michigan.
Materials
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Tris base | Sigma | #648310 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Decyl Maltoside | Sigma | D7658 | n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside |
| Octyl Glucoside | Sigma | O8001 | |
| Acrylamide | BioRad | 161-0148 | 37.5/1 C 40% solution |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| Ammonium Persulfate | BioRad | 161-0700 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 |
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