فحص وتحديد الببتيدات الصغيرة التي تستهدف عامل نمو الخلايا الليفية Receptor2 باستخدام مكتبه الببتيد العرض Phage
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لفحص الببتيدات الصغيرة التي تربط FGFR2 باستخدام مكتبه الببتيد العرض بالعاثيه. ونحن أيضا تحليل تقارب الببتيدات المحددة نحو FGFR2 في المختبر وقدرته علي قمع انتشار الخلايا.
Abstract
وتتالف أسره مستقبلات عامل النمو الليفي البشري (FGFR) من أربعه أعضاء ، وهي FGFR1 ، و FGFR2 ، و FGFR3 ، و FGFR4 ، التي تشارك في مختلف الانشطه البيولوجية بما في ذلك انتشار الخلايا ، والبقاء علي قيد الحياة ، والهجرة ، والتمايز. وقد تم تحديد العديد من الانحرافات في مسار الإشارات FGFR ، بسبب الطفرات أو احداث تضخيم الجينات ، في أنواع مختلفه من السرطانات. التالي ، ركزت البحوث الاخيره علي وضع استراتيجيات تنطوي علي استهداف علاجي لل FGFRs. مثبطات FGFRS الحالية في مراحل مختلفه من التطور قبل السريرية والسريرية تشمل اما مثبطات جزيء صغيره من كيناسيس تيروزين أو الأجسام المضادة الاحاديه ، مع فقط عدد قليل من مثبطات المستندة إلى الببتيد في خط الأنابيب. هنا ، ونحن نقدم بروتوكول باستخدام تقنيه عرض بالعاثيه لشاشه الببتيدات الصغيرة كخصوم من FGFR2. لفتره وجيزة ، تم احتضان مكتبه من الببتيدات المعروضة phage في لوحه المغلفة مع FGFR2. وفي وقت لاحق ، تم غسلها بالعاثيه غير منضم من قبل tbst (TBS + 0.1 ٪ [v/v] توين-20) ، وكان التملص من بالعاثيه ملزمه مع 0.2 M غليسين-HCl العازلة (pH 2.2). وتم تضخيم البالعاثيه الذي تم التملص منه واستخدامه كمدخل للجولة التالية من القرصنة البيولوجية. وبعد ثلاث جولات من القرصنة البيولوجية ، تم تحديد تسلسل الببتيد من الاستنساخ الفردي للفاج بتسلسل الحمض النووي. وأخيرا ، تم توليف الببتيدات التي تم فرزها وتحليلها للتقارب والنشاط البيولوجي.
Introduction
مستقبلات عامل النمو الليفي (FGFRs) تلعب أدوارا رئيسيه في انتشار الخلايا, التئام الجروح, وتولد الاوعيه في الجسم الحيوي1. التنشيط الشاذ من الإشارات fgfr لوحظ في مجموعه متنوعة من الأورام2,3,4,5 ويشمل تضخيم الجينات, الطفرات الجينية, الانحرافات الكروموسومات, والإفراط في إفراز الاربطه6 . وقد أظهرت العديد من مثبطات استهداف FGFRs الآثار العلاجية واعده في التجارب السريرية وتصنف أساسا إلى ثلاثه أنواع: (1) مثبطات جزيء كيناز الصغيرة ، والتي ترتبط المجال داخل الخلايا من FGFRS ، (2) الخصوم التي تستهدف الجزء خارج الخلية ، و (3) fgf يجند الفخاخ6. علي الرغم من ان العديد من مثبطات كيناز جزيء صغير لها اثار علاجيه جيده علي حد سواء في المختبر والجسم الآخر7, معظمهم لديهم الفقراء تحديد الهدف وتظهر الآثار الضارة مثل ارتفاع ضغط الدم8. غالبيه الخصوم هي الأجسام المضادة الاحاديه9،10 والبولي الببتيدات11. الببتيدات لها مزايا علي جزيئات صغيره بسبب خصوصيتها والآثار الجانبية السفلية. كما انها تحتفظ بنفاذيه الخلية ولا تتراكم في أجهزه محدده بالمقارنة مع الادويه البروتينية12. التالي ، الببتيدات الصغيرة المستهدفة هي عوامل علاجيه فعاله ومحتمله علي حد سواء.
Phage التكنولوجيا العرض هو أداه سهله ولكنها قويه لتحديد الببتيدات الصغيرة التي يمكن ان تربط إلى جزيء معين13،14،15. استخدمنا بالعاثيه العرض المكتبة الببتيد التي تقوم علي M13 بالعاثيه بسيطه مع أكثر من 109 تسلسل الببتيد مختلفه عرضها في الذيل للربط إلى جزيء الهدف (انظر جدول المواد)16. نظرا لتقارب عاليه من والعاثيات نحو جزيء معين ، والعاثيات غير منضم يمكن غسلها بعيدا ، ويتم الاحتفاظ فقط والعاثيات ملزمه باحكام مع الببتيدات القصيرة المطلوبة. الأهداف الجزيئية المعطية يمكن ان يتم تعبئتها البروتينات17،18، الكربوهيدرات، الخلايا المستزرعة ، أو حتى المواد غيرالعضوية 19 ،20. تم الإبلاغ عن حاله مثيره حيث تم اختيار الببتيدات الخاصة بالأعضاء في الجسم الخارجي باستخدام تقنيه عرض بالعاثيه21. مزايا التكنولوجيا عرض بالعاثيه وتشمل الانتاجيه العالية ، وسهوله التشغيل ، وانخفاض التكلفة ومجموعه واسعه من التطبيقات22.
في هذه الدراسة ، ونحن نقدم بروتوكول مفصل للكشف عن الببتيدات الصغيرة ملزمه للبروتين المعباه (FGFR2) باستخدام مكتبه عرض بالعاثيه. ويتم فحص فعاليه التكنولوجيا أيضا من خلال قياس تقارب الببتيد الذي تم الحصول عليه نحو FGFR2 بواسطة المعايرة الحرارية الكيميائية (ITC) ، والنشاط البيولوجي بواسطة فحص انتشار الخلايا. ويمكن تمديد الأسلوب للكشف عن الببتيدات الصغيرة التي تربط الكربوهيدرات, الخلايا المستزرعة, أو حتى المواد غير العضوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعد مكتبه التصوير التوافقي أداه قويه وفعاله للفحص العالي الإنتاجي للببتيدات الجديدة التي يمكنها ربط الجزيئات المستهدفة وتنظيم وظيفتها13. حاليا ، بالعاثيه المكتبات الببتيد العرض لديها مجموعه واسعه من التطبيقات. علي سبيل المثال, يمكن استخدامها لاختيار الببتيدات النشطة بيولو?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل برنامج العلوم والتكنولوجيا في قوانغتشو (رقم 2016201604030039).
Materials
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
Referenzen
- Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine & Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).
- Turner, N., Grose, R. Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).
- Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Matsumoto, K., et al. FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer. British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).
- Weiss, J., et al. Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer. Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).
- Babina, I. S., Turner, N. C. Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).
- Katoh, M. Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).
- Soria, J. C., et al. Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors. Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).
- French, D. M., et al. Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models. PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).
- Martinez-Torrecuadrada, J., et al. Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation. Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).
- Palamakumbura, A. H., et al. Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling. Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).
- Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).
- Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science. Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).
- Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries. Methods. 24 (3), 240-246 (2001).
- Rodi, D. J., Makowski, L. Phage-display technology – Finding a needle in a vast molecular haystack. Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).
- Sidhu, S. S. Engineering M13 for phage display. Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).
- Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding. Chemical Biology & Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).
- Askoxylakis, V., et al. Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta. Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).
- Chen, Y., et al. Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display. Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).
- Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
- Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
- Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries. Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).
- Binetruy-Tournaire, R., et al. Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis. The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).
- Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever. Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).
- Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries. Molecules. 16, 1211-1239 (2011).
- Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific. Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).
- Kelly, K. A., et al. Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma. PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).
- Sugihara, K., et al. Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis. Nature Communications. 5, 4478 (2014).
- Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display. Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).
- Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model. Science. 279, 377-390 (1997).
