Dépistage et identification des petits peptides ciblant le récepteur du facteur de croissance du fibroblaste2 à l'aide d'une bibliothèque de peptides d'affichage de phage
Summary
Ici, nous présentons un protocole détaillé pour le dépistage des petits peptides qui se lient à FGFR2 à l’aide d’une bibliothèque de peptides d’affichage de phage. Nous analysons en outre l’affinité des peptides sélectionnés vers FGFR2 in vitro et sa capacité à supprimer la prolifération cellulaire.
Abstract
La famille humaine des récepteurs du facteur de croissance du fibroblaste (FGFR) comprend quatre membres, à savoir FGFR1, FGFR2, FGFR3 et FGFR4, qui sont impliqués dans diverses activités biologiques, y compris la prolifération cellulaire, la survie, la migration et la différenciation. Plusieurs aberrations dans la voie de signalisation FGFR, en raison de mutations ou d’événements d’amplification des gènes, ont été identifiées dans divers types de cancers. Par conséquent, des recherches récentes ont porté sur l’élaboration de stratégies impliquant le ciblage thérapeutique des FGFR. Les inhibiteurs actuels du FGFR à divers stades du développement préclinique et clinique comprennent soit de petits inhibiteurs moléculaires de kinases tyrosines, soit monoclonal, avec seulement quelques inhibiteurs à base de peptides dans le pipeline. Ici, nous fournissons un protocole utilisant la technologie d’affichage de phage pour filtrer de petits peptides comme antagonistes de FGFR2. En bref, une bibliothèque de peptides phage-affichés a été incubée dans une plaque recouverte de FGFR2. Par la suite, le phage non lié a été lavé par tBST (TBS – 0,1 % [v/v] Tween-20), et le phage lié a été évuré avec un tampon de 0,2 M de glycine-HCl (pH 2,2). Le phage éluné a été amplifié et utilisé comme entrée pour la prochaine série de biopanning. Après trois séries de biopanning, les séquences peptidiques des clones individuels de phage ont été identifiées par séquençage d’ADN. Enfin, les peptides examinés ont été synthétisés et analysés pour l’affinité et l’activité biologique.
Introduction
Les récepteurs du facteur de croissance du fibroblaste (FGFRs) jouent un rôle clé dans la prolifération cellulaire, la cicatrisation des plaies et l’angiogenèse in vivo1. L’activation aberrante de la signalisation de FGFR observée dans une série de tumeurs2,3,4,5 inclut l’amplification de gène, les mutations de gène, les aberrations chromosomiques, et la sécrétion excessive de ligand6 . De nombreux inhibiteurs ciblant les FGFR ont montré des effets thérapeutiques prometteurs dans les essais cliniques et sont principalement classés en trois types : (1) les inhibiteurs de la kinase à petites molécules, qui se lient au domaine intracellulaire du FGFR, (2) antagonistes ciblant le segment extracellulaire, et (3) pièges fGF ligand6. Bien que plusieurs des inhibiteurs de kinase petite molécule ont de bons effets thérapeutiques à la fois in vitro et in vivo7, la plupart d’entre eux ont une faible spécificité cible et montrent des effets indésirables tels que l’hypertension8. La majorité des antagonistes sont des anticorps monoclonaux9,10 et des polypeptides11. Les peptides ont des avantages par rapport aux petites molécules en raison de leur spécificité et des effets secondaires inférieurs. Ils conservent également la perméabilité cellulaire et ne s’accumulent pas dans des organes spécifiques par rapport aux médicaments protéiques12. Par conséquent, les petits peptides ciblés sont à la fois des agents thérapeutiques efficaces et potentiels.
La technologie d’affichage de phage est un outil facile mais puissant pour identifier de petits peptides qui peuvent se lier à une molécule donnée13,14,15. Nous avons utilisé une bibliothèque de peptides d’affichage de phage qui est basée sur un phage simple m13 avec plus de 109 séquences de peptides différentes affichées à la queue pour se lier à la molécule cible (voir tableau des matériaux)16. En raison de la forte affinité des phages vers la molécule donnée, les phages non liés peuvent être lavés, et seuls les phages étroitement liés avec les peptides courts désirés sont conservés. Les cibles moléculaires données peuvent être des protéines immobilisées17,18, glucides, cellules cultivées, ou même des matériaux inorganiques19,20. Un cas passionnant a été rapporté où les peptides d’organe-spécifiques ont été choisis in vivo utilisant la technologie d’affichage de phage21. Les avantages de la technologie d’affichage de phage incluent le haut débit, la facilité d’opération, le coût bas et un large éventail d’applications22.
Dans cette étude, nous fournissons un protocole détaillé de criblage de petits peptides se liant à la protéine immobilisée (FGFR2) utilisant une bibliothèque d’affichage de phage. L’efficacité de la technologie est également examinée en mesurant l’affinité du peptide obtenu vers FGFR2 par la calorimétrie de titration isothermale (ITC), et l’activité biologique par un essai de prolifération de cellules. La méthode peut être étendue pour le dépistage de petits peptides qui se lient aux glucides, aux cellules cultivées ou même aux matériaux inorganiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une bibliothèque de phages combinatoire est un outil puissant et efficace pour le dépistage à haut débit de nouveaux peptides qui peuvent lier les molécules cibles et réguler leur fonction13. À l’heure actuelle, les bibliothèques de peptides d’affichage de phage ont un large éventail d’applications. Par exemple, ils peuvent être utilisés pour sélectionner les peptides bioactifs liés aux protéines réceptrices23, les cibles non protéiques24</…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Programme des sciences et de la technologie de Guangzhou (No. 2016201604030039).
Materials
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
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