Screening en identificatie van kleine peptiden gericht op fibroblast groei factor Receptor2 met behulp van een Phage display peptide Library
Summary
Hierin presenteren we een gedetailleerd protocol voor het screenen van kleine peptiden die binden aan FGFR2 met behulp van een faag display peptide Library. Verder analyseren we de affiniteit van de geselecteerde peptiden naar FGFR2 in vitro en het vermogen om celproliferatie te onderdrukken.
Abstract
De humane fibroblast growth factor receptor (FGFR) familie bestaat uit vier leden, namelijk FGFR1, FGFR2, FGFR3 en FGFR4, die betrokken zijn bij verschillende biologische activiteiten, waaronder celproliferatie, overleving, migratie en differentiatie. Verschillende aberraties in het FGFR-signalerings traject, als gevolg van mutaties of genamplificatie gebeurtenissen, zijn geïdentificeerd in verschillende soorten kankers. Daarom is recent onderzoek gericht op het ontwikkelen van strategieën met betrekking tot therapeutische targeting van FGFRs. huidige FGFR-remmers in verschillende stadia van pre-klinische en klinische ontwikkeling omvatten ofwel kleine molecuul remmers van tyrosine kinases of monoklonale antilichamen, met slechts enkele peptide-gebaseerde remmers in de pijpleiding. Hier bieden we een protocol met behulp van faag display technologie om kleine peptiden te schermen als antagonisten van FGFR2. Kort, een bibliotheek van phage-getoonde peptiden werd geïncubeerd in een plaat bedekt met FGFR2. Vervolgens werd ongebonden faag afgespoeld door TBST (TBS + 0,1% [v/v] tween-20), en gebonden faag werd geeleerd met 0,2 M glycine-HCL buffer (pH 2,2). De befaamde faag werd verder versterkt en gebruikt als input voor de volgende biopanning. Na drie rondes biopanning werden de peptide sequenties van individuele faag klonen geïdentificeerd door DNA-sequencing. Tot slot, de afgeschermde peptiden werden gesynthetiseerd en geanalyseerd voor affiniteit en biologische activiteit.
Introduction
Fibroblast groeifactor receptoren (FGFRs) spelen belangrijke rollen in celproliferatie, wondgenezing en angiogenese in vivo1. Afwijkende activering van fgfr-signalering waargenomen in een verscheidenheid van tumoren2,3,4,5 omvat genamplificatie, genmutaties, chromosomale afwijkingen en overmatige ligand secretie6 . Veel remmers gericht FGFRs hebben veelbelovende therapeutische effecten aangetoond in klinische proeven en zijn voornamelijk ingedeeld in drie soorten: (1) kleine molecuul kinase remmers, die binden aan het intracellulaire domein van FGFR, (2) antagonisten gericht op de extracellulair segment, en (3) FGF ligand traps6. Hoewel verscheidene van de kleine molecuul kinase remmers goede therapeutische effecten zowel in vitro en in vivo7, de meeste van hen hebben slechte doel specificiteit en vertonen nadelige effecten zoals hypertensie8. De meerderheid van de antagonisten zijn monoklonale antilichamen9,10 en poly peptides11. Peptiden hebben voordelen ten opzichte van kleine moleculen als gevolg van hun specificiteit en lagere bijwerkingen. Ze behouden ook de permeabiliteit van de cel en accumuleren niet in specifieke organen in vergelijking met eiwit drugs12. Vandaar, gerichte kleine peptiden zijn zowel effectieve en potentiële therapeutische agenten.
Phage display technologie is een eenvoudig maar krachtig hulpmiddel voor het identificeren van kleine peptiden die kunnen binden aan een bepaald molecuul13,14,15. We gebruikten een faag display peptide bibliotheek die is gebaseerd op een eenvoudige M13 faag met meer dan 109 verschillende peptide sequenties weergegeven aan de staart voor binding aan het doelwit molecuul (Zie tabel van de materialen)16. Vanwege de hoge affiniteit van Fagen naar het gegeven molecuul, kunnen ongebonden Fagen weggewassen worden, en alleen strak gebonden Fagen met de gewenste korte peptiden blijven behouden. De gegeven moleculaire doelen kunnen worden geïmmobiliseerd eiwitten17,18, koolhydraten, gekweekte cellen, of zelfs anorganische materialen19,20. Een spannende zaak werd gerapporteerd waar Orgaanspecifieke peptiden werden geselecteerd in vivo met behulp van faag Display Technology21. De voordelen van faag display technologie zijn onder andere een hoge doorvoer, bedieningsgemak, lage kosten en een breed scala aan toepassingen22.
In deze studie bieden we een gedetailleerd protocol voor het screenen van kleine peptiden binding aan het geïmmobiliseerde eiwit (FGFR2) met behulp van een faag display Library. De werkzaamheid van de technologie wordt ook onderzocht door het meten van de affiniteit van de verkregen peptide naar FGFR2 door isothermische titratie calorimetrie (ITC), en de biologische activiteit door een celproliferatie test. De methode kan worden uitgebreid voor het screenen van kleine peptiden die binden aan koolhydraten, gekweekte cellen, of zelfs anorganische materialen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een combinatorische faag-bibliotheek is een krachtig en effectief hulpmiddel voor de screening van nieuwe peptiden met een hoge doorvoer die doelwit moleculen kan binden en hun functie13kunnen reguleren. Op dit moment hebben faag display peptide bibliotheken een breed scala aan toepassingen. Bijvoorbeeld, ze kunnen worden gebruikt voor het selecteren van bioactieve peptiden gebonden aan receptor eiwitten23, niet-eiwit targets24,<sup class=…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het wetenschaps-en technologieprogramma van Guangzhou (nr. 2016201604030039).
Materials
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
Referenzen
- Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine & Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).
- Turner, N., Grose, R. Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).
- Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Matsumoto, K., et al. FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer. British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).
- Weiss, J., et al. Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer. Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).
- Babina, I. S., Turner, N. C. Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).
- Katoh, M. Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).
- Soria, J. C., et al. Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors. Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).
- French, D. M., et al. Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models. PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).
- Martinez-Torrecuadrada, J., et al. Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation. Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).
- Palamakumbura, A. H., et al. Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling. Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).
- Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).
- Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science. Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).
- Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries. Methods. 24 (3), 240-246 (2001).
- Rodi, D. J., Makowski, L. Phage-display technology – Finding a needle in a vast molecular haystack. Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).
- Sidhu, S. S. Engineering M13 for phage display. Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).
- Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding. Chemical Biology & Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).
- Askoxylakis, V., et al. Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta. Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).
- Chen, Y., et al. Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display. Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).
- Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
- Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
- Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries. Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).
- Binetruy-Tournaire, R., et al. Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis. The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).
- Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever. Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).
- Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries. Molecules. 16, 1211-1239 (2011).
- Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific. Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).
- Kelly, K. A., et al. Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma. PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).
- Sugihara, K., et al. Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis. Nature Communications. 5, 4478 (2014).
- Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display. Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).
- Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model. Science. 279, 377-390 (1997).
