Скрининг и идентификация малых пептидов Ориентация Фактор роста Фибробласты Рецептор2 с помощью Phage Дисплей Пептид библиотека
Summary
В этом случае мы представляем подробный протокол для скрининга небольших пептидов, которые связываются с FGFR2 с помощью фаговычного дисплея пептидной библиотеки. Мы также анализируем сродство выбранных пептидов к FGFR2 in vitro и его способность подавлять пролиферацию клеток.
Abstract
Человеческий рецептор фактора роста (FGFR) состоит из четырех членов, а именно, FGFR1, FGFR2, FGFR3 и FGFR4, которые участвуют в различных биологических деятельности, включая распространение клеток, выживание, миграцию и дифференциацию. Несколько аберраций в сигнальном пути FGFR, из-за мутаций или событий усиления генов, были выявлены в различных типах рака. Таким образом, последние исследования были сосредоточены на разработке стратегий, связанных с терапевтической ориентации FGFR. Текущие ингибиторы FGFR на различных стадиях доклинического и клинического развития включают либо небольшие молекулы ингибиторы тирозина киназы или моноклональных антител, с только несколько пептидных ингибиторов в трубопроводе. Здесь мы предоставляем протокол с использованием технологии фагового дисплея для проверки небольших пептидов в качестве антагонистов FGFR2. Короче говоря, библиотека фаговычных пептидов была инкубирована в тарелку, покрытую FGFR2. Впоследствии несвязанный фаг был смыт TBST (TBS – 0,1% “v/v” Tween-20), а связанный фаг был смыт с буфером 0,2 М глицин-HCl (pH 2.2). Элеттогенный фаг был дополнительно усилен и использован в качестве ввода для следующего раунда биопанирования. После трех раундов биопанирования пептидные последовательности отдельных фаговых клонов были идентифицированы по секвенированию ДНК. Наконец, экранированные пептиды были синтезированы и проанализированы на сродство и биологическую активность.
Introduction
Рецепторы фактора роста фибробластов (FGFRs) играют ключевую роль в пролиферации клеток, заживлении ран и ангиогенезе in vivo1. Аномальная активация FGFR сигнализации наблюдается в различных опухолей2,3,4,5включает в себя усилениегенов, генные мутации, хромосомные аберрации, и чрезмерной лиганд секреции6 . Многие ингибиторы, нацеленные на FGFR, показали многообещающее терапевтическое воздействие в клинических испытаниях и в основном классифицируются на три типа: (1) малые ингибиторы киназы молекулы, которые связываются с внутриклеточной областью FGFR, (2) антагонисты ориентации внеклеточного сегмента, и (3) FGF лиганд ловушки6. Хотя некоторые из небольших ингибиторов киназы молекулы имеют хорошие терапевтические эффекты как in vitro, так и in vivo7,большинство из них имеют плохую целевую специфичность и показывают неблагоприятные эффекты, такие как гипертония8. Большинство антагонистов являются моноклональные антитела9,10 и полипептиды11. Пептиды имеют преимущества перед небольшими молекулами из-за их специфичности и более низких побочных эффектов. Они также сохраняют проницаемость клеток и не накапливаются в определенных органах по сравнению с белковыми препаратами12. Таким образом, целевые небольшие пептиды являются как эффективными, так и перспективными терапевтическими агентами.
Технология отображения фагов является простым, но мощным инструментом для выявления небольших пептидов, которые могут связываться с данной молекулой13,14,15. Мы использовали фаговык пептид библиотеки, которая основана на простой m13 фаг с более чем 109 различных пептидных последовательностей отображается на хвосте для связывания с целевой молекулы (см. Таблица материалов)16. Из-за высокой сродства фагов к данной молекуле, несвязанные фаги могут быть смыты, и сохраняются только плотно связанные фаги с желаемыми короткими пептидами. Данные молекулярные цели могут быть обездвижены белки17,18,углеводы, культивированные клетки, или даже неорганические материалы19,20. Захватывающий случай был зарегистрирован, где орган конкретных пептидов были выбраны in vivo с использованием технологии фагового дисплея21. Преимущества технологии фагового дисплея включают высокую пропускную плату, простоту работы, низкую стоимость и широкий спектр приложений22.
В этом исследовании мы предоставляем подробный протокол скрининга малых пептидов, связывающихся с обездвиженным белком (FGFR2) с помощью библиотеки фагового дисплея. Эффективность технологии также изучена путем измерения сродства полученного пептида к FGFR2 по истермальной калорийности титрации (ITC), и биологической активности путем исследования пролиферации клеток. Метод может быть расширен для скрининга небольших пептидов, которые связываются с углеводами, культивированными клетками или даже неорганическими материалами.
Protocol
Representative Results
Discussion
Комбинаторная фагная библиотека является мощным и эффективным инструментом для высокой пропускной связи скрининга новых пептидов, которые могут связывать молекулы мишени и регулировать их функцию13. В настоящее время, фаговык пептид библиотеки имеют широкий спектр приме…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Научно-технической программой Гуанчжоу (No 2016201604030039).
Materials
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
Referenzen
- Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine & Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).
- Turner, N., Grose, R. Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).
- Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Matsumoto, K., et al. FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer. British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).
- Weiss, J., et al. Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer. Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).
- Babina, I. S., Turner, N. C. Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).
- Katoh, M. Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).
- Soria, J. C., et al. Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors. Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).
- French, D. M., et al. Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models. PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).
- Martinez-Torrecuadrada, J., et al. Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation. Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).
- Palamakumbura, A. H., et al. Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling. Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).
- Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).
- Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science. Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).
- Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries. Methods. 24 (3), 240-246 (2001).
- Rodi, D. J., Makowski, L. Phage-display technology – Finding a needle in a vast molecular haystack. Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).
- Sidhu, S. S. Engineering M13 for phage display. Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).
- Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding. Chemical Biology & Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).
- Askoxylakis, V., et al. Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta. Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).
- Chen, Y., et al. Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display. Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).
- Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
- Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
- Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries. Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).
- Binetruy-Tournaire, R., et al. Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis. The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).
- Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever. Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).
- Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries. Molecules. 16, 1211-1239 (2011).
- Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific. Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).
- Kelly, K. A., et al. Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma. PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).
- Sugihara, K., et al. Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis. Nature Communications. 5, 4478 (2014).
- Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display. Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).
- Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model. Science. 279, 377-390 (1997).
