בזאת, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לסינון פפטידים קטנים התאגד ל-FGFR2 באמצעות ספריית התצוגה הקטנה של phage. אנו לנתח עוד יותר את האהדה של הפפטידים שנבחרו כלפי FGFR2 בתוך מבחנה ויכולתה לדכא את תפוצת התאים.
מקדם הגדילה האנושי של הצמיחה פיברובסט (FGFR) מורכב מארבעה חברים, כלומר, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, המעורבים בפעילויות ביולוגיות שונות כולל הפצת תאים, הישרדות, הגירה ובידול. מספר סטיות במסלול האיתות FGFR, בשל מוטציות או אירועי הגברה גנטית, זוהו בסוגים שונים של סרטן. מכאן, מחקר שנערך לאחרונה התמקד בפיתוח אסטרטגיות מעורבות טיפולית של FGFRs. מעכבי FGFRS הנוכחי בשלבים שונים של התפתחות פרה-קליני וקליני כוללים מעכבי מולקולה קטנה של הקינזה או נוגדנים חד שבטיים, עם רק כמה פפטיד מבוססי מעכבי בצינור. כאן, אנו מספקים פרוטוקול באמצעות טכנולוגיית התצוגה phage למסך פפטידים קטנים כאנטוניסטים של FGFR2. בקצרה, ספריה של הפפטידים המוצגים phage היה מודבטים בצלחת מצופה עם FGFR2. לאחר מכן, phage לא מאוגד היה שטף על ידי TBST (TBS + 0.1% [v/v] יצירת רצף-20), ו phage מאוגד היה מוגבל עם 0.2 M גליצין-HCl מאגר (pH 2.2). והשתמשו בו כקלט. לסיבוב הבא בביואננינג בעקבות שלושה סיבובים של ביו ביונינג, רצפי פפטיד של שיבוטים phage בודדים זוהו על ידי רצפי DNA. לבסוף, הפפטידים הוקרן היו מסונתז ונותחו לפעילות זיקה וביולוגית.
קולטני הצמיחה פיברובסט (FGFRs) משחקים תפקידי מפתח בתפוצת תאים, ריפוי פצעים ואנגיוגנזה ב-vivo1. הפעלה חריגה של איתות fgfr נצפתה במגוון רחב של גידולים2,3,4,5 כולל הגברה גנטית, מוטציות גנים, סטיות כרומוזומלית, וליגונים מוגזמת6 . מעכבי רבים המיקוד fgfrs הראו השפעות טיפוליות מבטיחות בניסויים קליניים מסווגים בעיקר לשלושה סוגים: (1) מולקולה קטנה קינאז מעכבי, אשר לאגד את התחום התאיים של fgfrs, (2) האנטוניסטים מיקוד ה קטע מסחטות, ו (3) FGF ליגומלכודות6. למרות שכמה מעכבי מולקולה קטנה קינאז יש השפעות טיפוליות טובות הן בתחום החוץ והן ב vivo7, רובם יש ספציפיות היעד העניים ולהראות תופעות לוואי כגון יתר לחץ דם8. רוב האנטוניסטים הם נוגדנים חד-שבטיים9,10 ו פוליפפטידים11. פפטידים יש יתרונות על פני מולקולות קטנות בשל הספציפיות שלהם תופעות לוואי נמוכות. הם גם שומרים על חדירות התאים ואינם צוברים איברים ספציפיים לעומת תרופות החלבון12. מכאן, פפטידים קטנים ממוקדות הם יעילים ופוטנציאליים סוכנים רפואיים.
טכנולוגיית התצוגה phage הוא כלי קל אך חזק לזיהוי פפטידים קטנים אשר יכולים לאגד למולקולה נתונה13,14,15. השתמשנו בספרייה פפטיד להציג בספריה כי הוא מבוסס על M13 phage פשוטה עם מעל 109 רצפי פפטיד שונים מוצגים בזנב לכריכה למולקולה היעד (ראה טבלת חומרים)16. בשל הזיקה הגבוהה של phages לעבר מולקולה נתונה, phages לא מאוגד יכול להיות שטף משם, ורק מאוגד היטב phages עם פפטידים קצרים הרצוי נשמרים. מטרות מולקולריות נתון יכול להיות מקיבוע חלבונים17,18, פחמימות, תאים מתורבתים, או אפילו חומרים אורגניים19,20. מקרה מרגש דווח היכן הפפטידים הספציפיים לעוגב נבחרו בvivo באמצעות טכנולוגיית התצוגה phage21. היתרונות של טכנולוגיית התצוגה phage כוללים תפוקה גבוהה, קלות הפעולה, עלות נמוכה ומגוון רחב של יישומים22.
במחקר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של הקרנת פפטידים קטנים כריכת החלבון הקיבוע (FGFR2) באמצעות ספריית תצוגה phage. יעילותה של הטכנולוגיה נבדקת גם על ידי מדידת הזיקה של הפפטיד המתקבל כלפי FGFR2 על ידי איזותרמי טיטור קלורימטריה (הטכניון), ואת הפעילות הביולוגית על ידי שיטת הפצת תאים. ניתן להאריך את השיטה לסינון פפטידים קטנים הקושרים לפחמימות, לתאים מתורבתים או אפילו לחומרים לא אורגניים.
ספריית קומבינטורית phage הוא כלי רב עוצמה ויעיל עבור הקרנת תפוקה גבוהה של פפטידים הרומן שיכול לאגד את מולקולות היעד ולווסת את תפקידם13. בשלב זה, לספריות המוצגות באזור יש מגוון רחב של יישומים. לדוגמה, הם יכולים לשמש לבחירת הפפטידים אקטיביים מאוגד לקולטן חלבונים23, שאי?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המדע והטכנולוגיה של גואנגג’ואו (No. 2016201604030039).
0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
-96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
96-well plate | Nest | 701001-2 | |
Agar | Beyotime | ST004D | |
Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
DMF | Newprobe | PB10247 | |
EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
IPTG | Beyotime | ST097 | |
ITC200 system | MicroCal Omega | ||
NaCl | Sigma | S6191 | |
NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
NaI | Bidepharm | BD40879 | |
NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
X-gal | Beyotime | ST912 | |
Yeast extract | Oxoid | LP0021 |