هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لفحص الببتيدات الصغيرة التي تربط FGFR2 باستخدام مكتبه الببتيد العرض بالعاثيه. ونحن أيضا تحليل تقارب الببتيدات المحددة نحو FGFR2 في المختبر وقدرته علي قمع انتشار الخلايا.
وتتالف أسره مستقبلات عامل النمو الليفي البشري (FGFR) من أربعه أعضاء ، وهي FGFR1 ، و FGFR2 ، و FGFR3 ، و FGFR4 ، التي تشارك في مختلف الانشطه البيولوجية بما في ذلك انتشار الخلايا ، والبقاء علي قيد الحياة ، والهجرة ، والتمايز. وقد تم تحديد العديد من الانحرافات في مسار الإشارات FGFR ، بسبب الطفرات أو احداث تضخيم الجينات ، في أنواع مختلفه من السرطانات. التالي ، ركزت البحوث الاخيره علي وضع استراتيجيات تنطوي علي استهداف علاجي لل FGFRs. مثبطات FGFRS الحالية في مراحل مختلفه من التطور قبل السريرية والسريرية تشمل اما مثبطات جزيء صغيره من كيناسيس تيروزين أو الأجسام المضادة الاحاديه ، مع فقط عدد قليل من مثبطات المستندة إلى الببتيد في خط الأنابيب. هنا ، ونحن نقدم بروتوكول باستخدام تقنيه عرض بالعاثيه لشاشه الببتيدات الصغيرة كخصوم من FGFR2. لفتره وجيزة ، تم احتضان مكتبه من الببتيدات المعروضة phage في لوحه المغلفة مع FGFR2. وفي وقت لاحق ، تم غسلها بالعاثيه غير منضم من قبل tbst (TBS + 0.1 ٪ [v/v] توين-20) ، وكان التملص من بالعاثيه ملزمه مع 0.2 M غليسين-HCl العازلة (pH 2.2). وتم تضخيم البالعاثيه الذي تم التملص منه واستخدامه كمدخل للجولة التالية من القرصنة البيولوجية. وبعد ثلاث جولات من القرصنة البيولوجية ، تم تحديد تسلسل الببتيد من الاستنساخ الفردي للفاج بتسلسل الحمض النووي. وأخيرا ، تم توليف الببتيدات التي تم فرزها وتحليلها للتقارب والنشاط البيولوجي.
مستقبلات عامل النمو الليفي (FGFRs) تلعب أدوارا رئيسيه في انتشار الخلايا, التئام الجروح, وتولد الاوعيه في الجسم الحيوي1. التنشيط الشاذ من الإشارات fgfr لوحظ في مجموعه متنوعة من الأورام2,3,4,5 ويشمل تضخيم الجينات, الطفرات الجينية, الانحرافات الكروموسومات, والإفراط في إفراز الاربطه6 . وقد أظهرت العديد من مثبطات استهداف FGFRs الآثار العلاجية واعده في التجارب السريرية وتصنف أساسا إلى ثلاثه أنواع: (1) مثبطات جزيء كيناز الصغيرة ، والتي ترتبط المجال داخل الخلايا من FGFRS ، (2) الخصوم التي تستهدف الجزء خارج الخلية ، و (3) fgf يجند الفخاخ6. علي الرغم من ان العديد من مثبطات كيناز جزيء صغير لها اثار علاجيه جيده علي حد سواء في المختبر والجسم الآخر7, معظمهم لديهم الفقراء تحديد الهدف وتظهر الآثار الضارة مثل ارتفاع ضغط الدم8. غالبيه الخصوم هي الأجسام المضادة الاحاديه9،10 والبولي الببتيدات11. الببتيدات لها مزايا علي جزيئات صغيره بسبب خصوصيتها والآثار الجانبية السفلية. كما انها تحتفظ بنفاذيه الخلية ولا تتراكم في أجهزه محدده بالمقارنة مع الادويه البروتينية12. التالي ، الببتيدات الصغيرة المستهدفة هي عوامل علاجيه فعاله ومحتمله علي حد سواء.
Phage التكنولوجيا العرض هو أداه سهله ولكنها قويه لتحديد الببتيدات الصغيرة التي يمكن ان تربط إلى جزيء معين13،14،15. استخدمنا بالعاثيه العرض المكتبة الببتيد التي تقوم علي M13 بالعاثيه بسيطه مع أكثر من 109 تسلسل الببتيد مختلفه عرضها في الذيل للربط إلى جزيء الهدف (انظر جدول المواد)16. نظرا لتقارب عاليه من والعاثيات نحو جزيء معين ، والعاثيات غير منضم يمكن غسلها بعيدا ، ويتم الاحتفاظ فقط والعاثيات ملزمه باحكام مع الببتيدات القصيرة المطلوبة. الأهداف الجزيئية المعطية يمكن ان يتم تعبئتها البروتينات17،18، الكربوهيدرات، الخلايا المستزرعة ، أو حتى المواد غيرالعضوية 19 ،20. تم الإبلاغ عن حاله مثيره حيث تم اختيار الببتيدات الخاصة بالأعضاء في الجسم الخارجي باستخدام تقنيه عرض بالعاثيه21. مزايا التكنولوجيا عرض بالعاثيه وتشمل الانتاجيه العالية ، وسهوله التشغيل ، وانخفاض التكلفة ومجموعه واسعه من التطبيقات22.
في هذه الدراسة ، ونحن نقدم بروتوكول مفصل للكشف عن الببتيدات الصغيرة ملزمه للبروتين المعباه (FGFR2) باستخدام مكتبه عرض بالعاثيه. ويتم فحص فعاليه التكنولوجيا أيضا من خلال قياس تقارب الببتيد الذي تم الحصول عليه نحو FGFR2 بواسطة المعايرة الحرارية الكيميائية (ITC) ، والنشاط البيولوجي بواسطة فحص انتشار الخلايا. ويمكن تمديد الأسلوب للكشف عن الببتيدات الصغيرة التي تربط الكربوهيدرات, الخلايا المستزرعة, أو حتى المواد غير العضوية.
تعد مكتبه التصوير التوافقي أداه قويه وفعاله للفحص العالي الإنتاجي للببتيدات الجديدة التي يمكنها ربط الجزيئات المستهدفة وتنظيم وظيفتها13. حاليا ، بالعاثيه المكتبات الببتيد العرض لديها مجموعه واسعه من التطبيقات. علي سبيل المثال, يمكن استخدامها لاختيار الببتيدات النشطة بيولو?…
The authors have nothing to disclose.
وقد دعم هذا العمل برنامج العلوم والتكنولوجيا في قوانغتشو (رقم 2016201604030039).
0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
-96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
96-well plate | Nest | 701001-2 | |
Agar | Beyotime | ST004D | |
Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
DMF | Newprobe | PB10247 | |
EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
IPTG | Beyotime | ST097 | |
ITC200 system | MicroCal Omega | ||
NaCl | Sigma | S6191 | |
NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
NaI | Bidepharm | BD40879 | |
NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
X-gal | Beyotime | ST912 | |
Yeast extract | Oxoid | LP0021 |