Faj Görüntüleme Peptid Kütüphanesi Kullanılarak Fibroblast Büyüme Faktörü Reseptörü 2'yi Hedefleyen Küçük Peptidlerin Taranması ve Tanımlanması
Summary
Burada, faj görüntüleme peptid kütüphanesi kullanarak FGFR2’ye bağlanan küçük peptidlerin taranması için ayrıntılı bir protokol sayılmiyoruz. Seçilen peptidlerin FGFR2 in vitro’ya olan yakınlığını ve hücre çoğalmasını bastırma yeteneğini daha da analiz ediyoruz.
Abstract
İnsan Fibroblast Büyüme Faktörü Reseptörü (FGFR) ailesi, hücre çoğalması, sağkalım, göç ve farklılaşma gibi çeşitli biyolojik faaliyetlerde bulunan FGFR1, FGFR2, FGFR2, FGFR3 ve FGFR4 olmak üzere dört üyeden oluşur. FGFR sinyal yolunda mutasyonlar veya gen amplifikasyon olayları nedeniyle çeşitli kanser türlerinde çeşitli sapmalar tespit edilmiştir. Bu nedenle, son araştırmalar FGFR’lerin terapötik hedeflemesini içeren stratejiler geliştirmeye odaklanmıştır. monoklonal antikorlar, boru hattında sadece birkaç peptit bazlı inhibitörleri vardır. Burada, FGFR2 antagonistleri olarak küçük peptidler görüntülemek için faj ekran teknolojisini kullanarak bir protokol sağlar. Kısaca, faj görüntülenen peptidler bir kütüphane FGFR2 ile kaplı bir tabak içinde kuluçka yada oldu. Daha sonra, bağlanmamış faj TBST tarafından yıkandı (TBS + 0.1% [v/v] Tween-20), ve bağlı faj 0.2 M glisin-HCl tampon (pH 2.2) ile eluted edildi. Eluted faj daha da güçlendirilmiş ve biopanning bir sonraki tur için giriş olarak kullanılmıştır. Üç tur biopanning sonrasında, bireysel faj klonların peptid dizileri DNA dizilimi ile tespit edildi. Son olarak, taranmış peptidler sentezlendi ve yakınlık ve biyolojik aktivite için analiz edildi.
Introduction
Fibroblast büyüme faktörü reseptörleri (FGVR) hücre çoğalmasında, yara iyileşmesinde ve in vivo1’deanjiyogenezde kilit rol oynar. Çeşitli tümörlerde gözlenen FGFR sinyallerinin anormal aktivasyonu2,3,4,5 gen amplifikasyonu, gen mutasyonları, kromozom salamanasyonları ve aşırı ligand salgılanması6 . FGFR’leri hedef alan birçok inhibitör klinik çalışmalarda umut verici terapötik etkiler göstermiştir ve esas olarak üç tipe ayrılır: (1) fgfr hücre içi etki alanına bağlanan küçük molekül kinaz inhibitörleri, (2) antagonistleri hücre dışı segment ve (3) FGF ligand tuzakları6. Küçük molekül kiazaz inhibitörleri birkaç in vitro ve in vivo7hem de iyi terapötik etkileri olmasına rağmen, bunların çoğu kötü hedef özgüllüğü var ve hipertansiyon gibi yan etkiler göstermektedir8. Antagonistlerin çoğunluğu monoklonal antikorlar9,10 ve polipeptidler11. Peptidler özgüllük leri ve düşük yan etkileri nedeniyle küçük moleküllere göre avantajlıdır. Ayrıca hücre geçirgenliğini korurlar ve protein ilaçlarına göre belirli organlarda birikmezler12. Bu nedenle, hedeflenen küçük peptidler hem etkili ve prospektif terapötik ajanlardır.
Faj ekran teknolojisi belirli birmolekül13,14,15bağlanabilir küçük peptidler tanımlamak için kolay ama güçlü bir araçtır. Biz hedef moleküle bağlanmak için kuyruk görüntülenen 109 farklı peptid dizileri ile basit bir M13 faj dayalı bir faj ekran peptid kütüphane kullanılır (Malzeme Tablosubakınız )16. Verilen moleküle fajların yüksek yakınlığı nedeniyle, bağlanmamış fajlar yıkanabilir ve sadece istenilen kısa peptidler ile sıkıca bağlanmış fajlar korunur. Verilen moleküler hedefler immobilize proteinler olabilir17,18, karbonhidratlar, kültürlü hücreler, hatta inorganik maddeler19,20. Heyecan verici bir durumda nerede organa özgü peptidler faj ekran teknolojisi kullanılarak in vivo seçildibildirilmiştir 21. Faj görüntüleme teknolojisinin avantajları arasında yüksek iş gücü, çalışma kolaylığı, düşük maliyet ve çok çeşitli uygulamalar22bulunmaktadır.
Bu çalışmada, faj görüntüleme kitaplığı kullanılarak immobilize proteine (FGFR2) bağlanan küçük peptidlerin taranması için ayrıntılı bir protokol sunuz. Teknolojinin etkinliği, elde edilen peptidin FGFR2’ye olan yakınlığı nın Izothermal Titrasyon Kalorimetresi (ITC) ile ölçülmesi ve hücre çoğalması tahkikatı ile biyolojik aktivite ile de incelenir. Yöntem karbonhidratlar, kültürlü hücreler, hatta inorganik maddelere bağlanan küçük peptidlerin taranması için uzatılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir kombinatoryal faj kütüphane hedef molekülleri bağlamak ve fonksiyonlarını düzenleyen yeni peptidlerin yüksek iş letiyet tarama için güçlü ve etkili bir araçtır13. Şu anda, faj ekran peptid kütüphaneleri uygulamaları geniş bir yelpazede var. Örneğin, onlar reseptör proteinlerine bağlı biyoaktif peptidler seçmek için kullanılabilir23, non-protein hedefleri24,25, hastalığa özgü antij…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Guangzhou Bilim ve Teknoloji Programı (No. 2016201604030039) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
Referenzen
- Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine & Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).
- Turner, N., Grose, R. Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).
- Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Matsumoto, K., et al. FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer. British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).
- Weiss, J., et al. Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer. Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).
- Babina, I. S., Turner, N. C. Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).
- Katoh, M. Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).
- Soria, J. C., et al. Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors. Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).
- French, D. M., et al. Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models. PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).
- Martinez-Torrecuadrada, J., et al. Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation. Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).
- Palamakumbura, A. H., et al. Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling. Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).
- Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).
- Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science. Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).
- Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries. Methods. 24 (3), 240-246 (2001).
- Rodi, D. J., Makowski, L. Phage-display technology – Finding a needle in a vast molecular haystack. Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).
- Sidhu, S. S. Engineering M13 for phage display. Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).
- Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding. Chemical Biology & Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).
- Askoxylakis, V., et al. Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta. Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).
- Chen, Y., et al. Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display. Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).
- Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
- Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
- Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries. Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).
- Binetruy-Tournaire, R., et al. Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis. The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).
- Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever. Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).
- Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries. Molecules. 16, 1211-1239 (2011).
- Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific. Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).
- Kelly, K. A., et al. Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma. PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).
- Sugihara, K., et al. Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis. Nature Communications. 5, 4478 (2014).
- Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display. Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).
- Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model. Science. 279, 377-390 (1997).
