Dynamique d'oligomerisation des récepteurs de surface cellulaire dans les cellules vivantes par microscopie de fluorescence interne totale combinée à l'analyse du nombre et de la luminosité

Summary

Nous décrivons une approche de formation image pour la détermination de l’état oligomeric moyen des oligomères mEGFP-marqué-récepteurs induits par la liaison de ligand dans la membrane de plasma des cellules vivantes. Le protocole est basé sur la microscopie de la fluorescence de la réflexion interne totale (TIRF) combinée à l’analyse du nombre et de la luminosité (N-B).

Abstract

Malgré l’importance et l’omniprésence de l’oligomerisation des récepteurs, peu de méthodes sont applicables pour détecter les événements de regroupement et mesurer le degré de regroupement. Ici, nous décrivons une approche de formation image pour déterminer l’état oligomeric moyen des homocomplexes mEGFP-marqué-récepteur dans la membrane des cellules vivantes. Le protocole est basé sur la microscopie de la fluorescence de la réflexion interne totale (TIRF) combinée à l’analyse du nombre et de la luminosité (N-B). La méthode est une méthode semblable à la spectroscopie de corrélation fluorescence (FCS) et à l’histogramme de comptage de photons (PCH), qui sont basées sur l’analyse statistique des fluctuations de l’intensité de fluorescence des fluorophores diffusant dans et hors d’un éclairage volume pendant un temps d’observation. En particulier, n’est une simplification de PCH pour obtenir des informations sur le nombre moyen de protéines dans les mélanges d’oligomériques. Les amplitudes de fluctuation d’intensité sont décrites par la luminosité moléculaire du fluorophore et le nombre moyen de fluorophores dans le volume d’illumination. Ainsi, N-B ne considère que les premier et deuxième moments de la distribution de l’amplitude, à savoir l’intensité moyenne et la variance. C’est, en même temps, la force et la faiblesse de la méthode. Étant donné que seulement deux moments sont pris en considération, n’est pas en passe de déterminer la fraction molaire des oligomères inconnus dans un mélange, mais elle n’estime que l’état moyen d’oligomerisation du mélange. Néanmoins, il peut être appliqué à des séries chronologiques relativement petites (par rapport à d’autres méthodes de moment) d’images de cellules vivantes sur une base pixel par pixel, simplement en surveillant les fluctuations temporelles de l’intensité de la fluorescence. Il réduit le temps efficace par pixel à quelques microsecondes, permettant l’acquisition dans la plage de temps de secondes à millisecondes, ce qui est nécessaire pour la cinétique d’oligomerisation rapide. Enfin, de grandes zones cellulaires ainsi que des compartiments sous-cellulaires peuvent être explorés.

Introduction

Nous décrivons une approche d’imagerie de fluorescence et de luminosité de réflexion interne totale (TIRF-N-B) pour déterminer l’état oligomeric moyen des molécules de récepteur à la membrane de plasma des cellules vivantes, visant à relier l’assemblage de récepteur dynamique à la fonction biologique des protéines (Figure 1).

Sur la liaison extracellulaire de ligand, les récepteurs initient la transduction intracellulaire de signal selon leur conformation, oligomerization, co-récepteurs potentiels et composition de membrane. Malgré l’importance et l’omniprésence de l’oligomerisation des récepteurs, reconnu comme un événement clé dans la signalisation cellulaire^{1,2,3,4,5,6, 7}, peu de méthodes peuvent détecter les événements de clustering et mesurer le degré de clustering expérimentalement^8,9. Le volume confocal (x,y 300 nm, z ‘900 nm) est insuffisamment résolu pour prouver l’interaction moléculaire et la stoichiométrie, même après optimisation par des algorithmes de restauration d’image¹⁰. La composition sous-unité des oligomères protéiques ne peut pas être résolue sur une base purement spatiale, même par des méthodes de super-résolution à x, y résolution de 20-70 nm tels que PALM¹¹, STORM¹², et STED¹³. En outre, leur résolution temporelle (de l’ordre de minutes par image) ne peut pas suivre la cinétique dans la gamme de secondes. Le blanchiment par étapes d’une seule molécule ne résout la stoichiométrie des oligomères protéiques que s’ils sont immobiles¹⁴.

L’une des méthodes les plus polyvalentes pour mesurer la densité et l’oligomerisation des protéines étiquetées fluorescentes dans des images uniques est l’analyse de distribution de l’intensité spatiale (SpIDA), qui repose sur l’échantillonnage spatial. Il s’applique à la fois aux cellules fixes et vivantes chimiquement, et permet l’analyse de plusieurs régions d’intérêt de la cellule simultanément en utilisant la microscopie de fluorescence standard¹⁵. Alternativement, les méthodes de moment, telles que la spectroscopie de fluorescence-corrélation (FCS)^16,l’histogramme de comptage de photon (PCH)^17,et le nombre et la luminosité (N et B)^18,19,sont appropriés pour l’oligomère quantitatif Mesures. Ces méthodes analysent les fluctuations d’intensité de fluorescence qui peuvent être observées à temps lorsque les fluorophores se diffusent dans et hors d’un volume d’éclairage. Les amplitudes des fluctuations d’intensité peuvent être décrites de façon unique par la luminosité moléculaire du fluorophore (mD) et le nombre moyen de fluorophores (n) dans le volume d’éclairage¹⁷ (figure 2). Typiquement, le coefficient de diffusion des fluorophores et le nombre moyen de molécules (inversement liés à la valeur G(0) dans le volume d’éclairage peuvent être obtenus par FCS²⁰. Cependant, puisque le temps de diffusion ne s’écaille qu’avec la racine cubique de la masse, le FCS n’est pas suffisamment sensible pour détecter les changements de masse moléculaire²¹. Dans la pratique, FCS de couleur unique ne peut pas détecter la dimerisation des récepteurs membranaires. PCH résout avec précision les mélanges de différents oligomères. À l’aide de plus de deux moments de la distribution de l’amplitude, il détecte des molécules d’une luminosité différente qui occupent le même volume d’éclairage. Balayage FCS²² et les développements, tels que l’intéressante paire-corrélation de la luminosité moléculaire (pCOMB) approche²³, introduit pour étendre la gamme d’applicabilité des méthodes de corrélation de fluorescence dans les systèmes biologiques²⁴ , restent des méthodes à point unique dépourvues de la capacité de mesures rapides dans une grande zone d’une cellule, nécessitant de nombreuses observations consécutives à chaque pixel et acquisition de données dans l’ordre de secondes.

N-B est une version simplifiée de PCH qui ne tient compte que des premiers et deuxièmes moments de l’amplitude de la distribution de fluorescence, à savoir l’intensité moyenne, lt;I-gt;, et la variance,^‘2 (Figure 2)^18,19 et, pour cette raison, il ne peut pas déterminer la fraction molaire des oligomères inconnus dans un mélange, mais seulement estime l’état moyen d’oligomerisation du mélange. Néanmoins, n’a l’avantage de travailler avec des séries temporelles d’images de cellules vivantes relativement plus petites que PCH sur une base pixel par pixel, simplement en surveillant les fluctuations à l’heure de l’intensité de la fluorescence. Étant donné que le temps par pixel réduit le temps par pixel à quelques microsecondes, il peut suivre la cinétique d’oligomerisation rapide sur de grandes zones cellulaires, permettant l’acquisition d’images sur une échelle de temps de secondes dans la microscopie de balayage de raster (par exemple, confocal, 2-photon) et millisecondes microscopie à la caméra (p. ex. TIRFM).

Plusieurs rapports ont démontré la capacité de N-B à quantifier le nombre de sous-unités dans les grappes de protéines par imagerie des régions cellulaires étendues. Des amas de Paxillin-EGFP ont été détectés aux emplacements d’adhérence dans les cellules de CHO-K1^25,et l’agrégation intracellulaire du peptide pathogène de Httex1p a été décrite dans les cellules coS-7^26. Le n et B a été appliqué pour suivre l’oligomerisation ligand-conduite du récepteur d’ErbB^27,et l’effet du ligand FGF21 sur Klothob (KLB) et FGFR1c dans les cellules de HeLa²⁸. La combinaison de l’imagerie TIRF et de l’analyse N-B a été utilisée pour montrer que le dynamin-2 est principalement tétracumé dans toute la membrane cellulaire²⁹. Nous avons appliqué n’et B à la fois raster balayage et images TIRF pour prouver ligand-conduit dimerization des récepteurs de membrane cellulaire uPAR et FGFR1^30,31.

Les méthodes de corrélation de fluorescence, telles que le N-B, le FCS et le PCH, sont basées sur l’idée que dans un volume ouvert le nombre d’occupation des particules suit une distribution de Poisson. Parce que seuls les photons que les fluorophores émettent peuvent être détectés, la valeur moyenne d’une intensité de fluorescence mesurée par rapport au temps dans un pixel de l’image, est le produit du nombre moyen de fluorophores dans le volume d’éclairage, n, et leur luminosité moléculaire,¹⁷euros :

où le nombre de photons émis par unité de temps (conventionnellement par seconde) par molécule lorsque la molécule est au centre du volume d’éclairage.

La luminosité est une propriété de chaque fluorophore dans une acquisition donnée mise en place, tandis que l’intensité est la somme de toutes les contributions de tous les fluorophores. Dans les concours biologiques, la luminosité augmentera avec l’augmentation du nombre de fluorophores qui fluctuent ensemble, donnant des informations sur l’état d’oligomerisation de la protéine fluorescente. Les amplitudes de fluctuation à un pixel donné sont mesurées à partir de la variance du signal de fluorescence,^{no 2}:

Lorsque la moyenne du carré d’intensité, et le carré de la moyenne de l’intensité, , sont calculer à partir des valeurs d’intensité individuelle dans chaque pixel de chaque image:

où K est le nombre total d’images dans la série chronologique. Expérimentalement, il est nécessaire de calculer pour l’ensemble de la série d’images la variance qui décrit la diffusion des valeurs d’intensité individuelles à chaque pixel d’une seule image autour de la valeur moyenne de l’intensité. La variance comprend toutes les fluctuations d’origines différentes. Dans une première approximation, la variance due aux particules de diffusion dans le volume d’éclairage,²₀, peut être séparée de la variance en raison du bruit de tir du détecteur,²_d. Les deux écarts sont indépendants; ainsi, l’écart total est donné par leur somme :

La variance, due aux fluctuations moléculaires dans et hors du volume de détection, dépend linéairement de la luminosité et de l’intensité moléculaires :

Réorganisation eq. 6 selon eq. 1:

Selon le concept typique de la spectroscopie de corrélation de fluorescence, l’équation 7 indique que la variance due au nombre de fluctuations dépend du carré de la luminosité des particules.

Ensuite, la variance due aux fluctuations du détecteur est une fonction linéaire de l’intensité détectée, en supposant que le détecteur est exploité en dessous de sa limite de saturation¹⁹:

Dans le cas des détecteurs de comptage de photons de1 et de 0,la variance du détecteur est donc égale à l’intensité moyenne :

Pour appliquer ces concepts à des mesures réelles dans des cellules vivantes, Gratton et ses collègues¹⁸ définissent la luminosité apparente, B, pour chaque pixel comme le rapport de la variance par rapport à l’intensité moyenne :

B est le paramètre qui est mesuré expérimentalement. Dans ce travail, les images de séries chronologiques des récepteurs FGFR1 à la membrane plasmatique des cellules HeLa sont capturées par microscopie TIRF et la luminosité apparente moyenne, B, est déterminée par l’analyse N et B. Puis, après l’ajout de FGF2, des séries chronologiques consécutives sont capturées pour suivre les changements dans l’auto-assemblage des molécules de récepteur dans la surface de membrane après stimulation du récepteur avec le ligand canonique.

Cependant, puisque le détecteur du microscope TIRF est une caméra EMCCD, l’expression de la luminosité apparente doit être modifiée comme¹⁹:

lorsque le décalage est le décalage d’intensité de l’électronique de détection qui est une caractéristique des paramètres du détecteur. La variance et l’intensité moyenne d’un détecteur analogique sont données respectivement par :

où G est le gain analogique dans les niveaux numériques (DL/photons), S, les niveaux numériques par photon¹⁹, est donné par la pente d’une intensité par rapport à l’intrigue de variance pour une source lumineuse avec une intensité constante (pas de fluctuations temporelles). Le facteur de l’aétée est lié à la forme du volume de détection des pixels. Selon Hassler et coll.³², le facteur d’aété est égal à 0,3 pour l’imagerie TIRF travaillant au gain maximum de la caméra de détection¹⁹. Les paramètres de décalage, S et G sont des caractéristiques de la caméra et du microscope. La luminosité apparente, B, est obtenue en réorganisant eq. 11 selon eq. 12 et 13:

Expérimentalement, est une fonction complexe de l’intensité laser et de l’efficacité de détection du système. Néanmoins, étant donné que le B/S dépend linéairement de l’activité, il est seulement important de déterminer la valeur relative de l’application pour un mode de détection donné :

où est proportionnelle à la proportion de ‘ Pourtant, un étalonnage est effectué à l’aide d’une référence interne.

Protocol

1. Préparation de l’échantillon Jour 1. Cellules HeLa de graine dans le milieu complet à une concentration de 100.000-200.000 cellules/mL dans les plats en verre-fond. Graines 6-8 reproduire les plats.REMARQUE: Dans cet exemple, le milieu est complété par 10% de chaleur inactivée sérum bovin fœtal (FBS), 1 mM de pyruvate de sodium, 100 U/100 g de pénicilline/streptomycine. Plusieurs plats reproduits sont préparés. Jour 2-3. Lorsque les cellules sont sous-confluences, tr…

Representative Results

Les résultats de deux cellules représentatives HeLa-mEGFP-FGFR1 ensemées dans le même plat de culture sont présentés dans la figure 5 et le tableau supplémentaire 1. Les deux cellules ont été capturées à l’époque 0 min (Figure 5A, top) et 7 min (Figure 5A, bottom) après l’ajout du ligand FGF2. <p class="jove_content" fo:keep-together…

Discussion

La N-B exige plusieurs précautions dans le choix du modèle cellulaire et de la stratégie d’étiquetage. Il ne peut être appliqué qu’aux cellules vivantes qui restent stablement respectées pendant le temps de capture d’image. Les fluctuations supplémentaires dues à l’ensemble du déplacement rigide de la cellule peuvent être traitées avec des approches appropriées de restauration d’image³⁸. Cependant, généralement quand une cellule se déplace, la membrane cellulaire se déforme égale…

Materials

3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100×1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	21063029	Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10566-016	Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Biowest, Nuaillé, France	X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2	TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10270106	10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes	MatTek, Ashland, MA, USA	P35G-0.170-14-C	uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells	Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany	CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software	Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK		This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b	The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA		download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x	Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA	LONZA 17-602E	supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector	Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy		Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2	PeproTech EC, Ltd., London, UK		Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO	ThermoFisher Scientific	11360070	1mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent	MirusBio LLC, Madison, WI, USA	MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	25200056
Type F Immersion liquid 10 mL	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	AM2618	0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections