Динамика олигомеризации рецепторов поверхности клеток в живых клетках с помощью общей внутренней флуоресценции в сочетании с анализом числа и яркости

Summary

Мы описываем подход к визуализации для определения среднего олигомерного состояния mEGFP-тегами-рецепторами олигомеров, индуцированных связыванием лиганд в плазменной мембране живых клеток. Протокол основан на микроскопии Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) в сочетании с анализом числа и яркости (N и B).

Abstract

Несмотря на важность и повсеместность олигомеризации рецепторов, для обнаружения событий кластеризации и измерения степени кластеризации применяется несколько методов. Здесь мы описываем подход к визуализации для определения среднего олигомерного состояния mEGFP-тегами-рецепторами гомокомплексов в мембране живых клеток. Протокол основан на микроскопии Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) в сочетании с анализом числа и яркости (N и B). Н З/Б – это метод, похожий на флуоресценцию-корреляционную спектроскопию (FCS) и фотон, считающий гистограмму (PCH), которые основаны на статистическом анализе колебаний интенсивности флюорофорора, распространяющихся в и из освещения объема во время наблюдения. В частности, Н И Б является упрощением ПХГ для получения информации о среднем количестве белков в олигомерных смесях. Амплитуды интенсивности описываются молекулярной яркостью фторофора и средним количеством флюорофоров в объеме освещения. Таким образом, Н З/Б рассматривает только первый и второй моменты распределения амплитуды, а именно, средняя интенсивность и дисперсия. Это, в то же время, сила и слабость метода. Поскольку учитываются только два момента, Н И Б не может определить моляровую фракцию неизвестных олигомеров в смеси, но она оценивает только среднее состояние олигомеризации смеси. Тем не менее, он может быть применен к относительно небольшим сериям времени (по сравнению с другими методами) изображений живых клеток на пиксельной основе, просто отслеживая временные колебания интенсивности флуоресценции. Это уменьшает эффективное время на пиксель до нескольких микросекунд, что позволяет приобретения в диапазоне секунд до миллисекунд, что необходимо для быстрой кинетики олигомеризации. Наконец, можно исследовать большие клеточные области, а также субклеточные отсеки.

Introduction

Мы описываем подход к визуализации Total Internal Reflection Fluorescence-Number и Brightness (TIRF-N’amp;B) для определения среднего олигомерного состояния молекул рецепторов в плазменной мембране живых клеток, направленных на увязку рецепторной сборки динамика к биологической функции белков(Рисунок 1).

При внеклеточном связывании лиганд рецепторы инициируют трансдукцию внутриклеточного сигнала в зависимости от их конформации, олигомеризации, потенциальных корецепторов и мембранного состава. Несмотря на важность и повсеместность олигомеризации рецепторов, признанных ключевым событием в клеточной сигнализации^{1,2,3,4,5,6, 7}, несколько методов могут обнаружить события кластеризации и измерить степень кластеризации экспериментально^8,9. Конфокальный объем (x,y’300 nm, z z 900 nm) недостаточно решен для доказательства молекулярного взаимодействия и стоихиометрии, даже после оптимизации алгоритмами восстановления изображения¹⁰. Подедины состав белковых олигомеров не может быть решен на чисто пространственной основе даже с помощью супер-разрешения методов на х, разрешение 20-70 нм, таких как PALM¹¹, STORM¹², и STED¹³. Более того, их временное разрешение (в порядке минут на изображение) не может следовать за кинетиками в диапазоне секунд. Одномолекулярная ступенчатое отбеливание разрешает стойихиометрию белковых олигомеров только в том случае, если они неподвижны^14.

Одним из наиболее универсальных методов измерения плотности и олигомеризации флуоресцентно отмеченных белков в пределах одного изображения является анализ распределения пространственной интенсивности (SpIDA), который опирается на пространственную выборку. Он применим как к химически фиксированным, так и к живым клеткам, и позволяет анализировать несколько областей, представляющих интерес для клетки, одновременно с помощью стандартной флуоресценции¹⁵. Кроме того, методы момента, такие как флуоресценция-корреляция спектроскопии (FCS)¹⁶, фотон подсчета гистограммы (PCH)¹⁷, и количество и яркость (N и B)^18,19, подходят для количественного олигомера Измерения. Эти методы анализируют колебания интенсивности флуоресценции, которые могут наблюдаться во времени, когда фторфоры рассеивается в и из объема освещения. Амплитуда колебаний интенсивности можно однозначно описать молекулярной яркостью флюорофора (к) и средним количеством флюорофоров (n) в пределах объема освещения¹⁷ (Рисунок 2). Как правило, коэффициент диффузии фторфоров и среднее количество молекул (обратно связанных с значением G(0) в пределах объема освещения могут быть получены FCS^20. Однако, так как время диффузии только масштабируется с кубической корнем массы, FCS не является достаточно чувствительным для обнаружения изменений в молекулярной массе²¹. На практике, один цвет FCS не может обнаружить димеризацию мембранных рецепторов. PCH разрешает смеси различных олигомеров точно. Используя более двух мгновений распределения амплитуды, он обнаруживает молекулы разной яркости, которые занимают один и тот же объем освещения. Сканирование FCS²² и разработки, такие как интересная парно-корреляция молекулярной яркости (pCOMB) подход²³, введены для расширения диапазона применимости методов корреляции флуоресценции в биологических системах²⁴ , остаются одноточечными методами, не имеющими возможности быстрых измерений на большой площади ячейки, требующих много последовательных наблюдений на каждом пикселе и получения данных в порядке секунд.

Н З/Б является упрощенной версией PCH, которая учитывает только первый и второй моменты амплитуды распределения флуоресценции, а именно, средняя интенсивность, lt; I’gt;, и дисперсия,^{No 2} (Рисунок 2)^18,19 и, из-за этого, он не может определить моляровую фракцию неизвестных олигомеров в смеси, а лишь оценивает среднее состояние олигомеризации смеси. Тем не менее, Н И Б имеет то преимущество, что работает с относительно меньшими временные ряды изображений живых клеток, чем PCH на пиксель за пикселем основе, просто путем мониторинга колебаний во времени флуоресценции интенсивности. Поскольку Н И Б сокращает время за пикселем до нескольких микросекунд, он может следить за быстрой кинетикой олигомеризации на больших клеточных площадях, позволяя присугнять изображение в временной шкале секунд в сканирующей микроскопии (например, confocal, 2-фотон) и миллисекундах микроскопии на основе камеры (например, TIRFM).

В нескольких докладах была продемонстрирована способность Н И Б количественно очислять количество субъединиц в белковых кластерах с помощью визуализации расширенных клеточных регионов. Кластеры Paxillin-EGFP были обнаружены на участках адгезии в клетках CHO-K1^25,а внутриклеточная агрегация патогенного пептида Httex1p была описана в клетках COS-7²⁶. Н З/Б был применен для следующих лиганд-управляемых олигомеризации рецептора ErbB²⁷, и влияние лиганд FGF21 на Klothob (KLB) и FGFR1c в клетках HeLa²⁸. Сочетание tIRF изображений и N и B анализ был использован, чтобы показать, что динамин-2 в первую очередь тетрамерические всей клеточной мембраны²⁹. Мы применили N и B как raster сканирования и TIRF изображения доказать лиганд-управляемый димеризации uPAR и FGFR1 клеточных мембранных рецепторов^30,31.

Методы корреляции флуоресценции, такие как Н И Б, FCS и PCH, основаны на том, что в открытом томе число частиц следует за распределением Пуассона. Потому что только фотоны, что фторофоры излучают могут быть обнаружены, среднее значение для измеренной интенсивности флуоресценции по сравнению со временем в пикселе изображения, является продуктом среднего количества флюорофоров в объеме освещения,, и их молекулярная яркость, No¹⁷:

где выражено как количество фотонов, испускаемых на единицу времени (обычно в секунду) на молекулу, когда молекула находится в центре объема освещения.

Яркость является свойством каждого фторофора в данном приобретении создана, в то время как интенсивность сумма всех взносов от всех фторофоров. В биологических конкурсах, яркость будет увеличиваться с увеличением числа флюорофоров, которые колеблются вместе, давая информацию о состоянии олигомеризации флуоресцентно помечены белка. Амплитуда колебаний на данном пикселе измеряется из дисперсии сигнала флуоресценции,^{No 2}:

Где среднее значение квадрата интенсивности, и квадрат среднего интенсивности, , вычисляются из индивидуальных значений интенсивности в каждом пикселе каждого кадра:

где K — это количество общих кадров в временных рядах. Экспериментально необходимо вычислить для всей серии изображений дисперсию, описывающая рассеяние значений индивидуальной интенсивности на каждом пикселе одного изображения вокруг значения средней интенсивности. Разница включает в себя все колебания разного происхождения. В первом приближении, дисперсия из-за рассеяния частиц в объеме освещения,²₀, могут быть отделены от дисперсии из-за шума выстрела детектора,²_d. Эти два отклонения являются независимыми; таким образом, общая дисперсия дается их сумма:

Разница, из-за молекулярных колебаний в и из объема обнаружения, линейно зависит от молекулярной яркости и интенсивности:

Перестановка eq. 6 в соответствии с eq. 1:

Согласно типичной концепции флуоресценции корреляции спектроскопии, уравнение 7 гласит, что дисперсия из-за количества колебаний зависит от квадрата яркости частицы.

Затем, дисперсия из-за колебаний детектора является линейной функцией обнаруженной интенсивности, при предположении, что детектор работает ниже предела насыщения¹⁹:

В случае фотонововых детекторов 1и с0, таким образом, дисперсия детектора равна средней интенсивности:

Чтобы применить эти понятия к реальным измерениям в живых клетках, Gratton и его коллеги¹⁸ определяют кажущуюся яркость, B, для каждого пикселя как соотношение дисперсии над средней интенсивностью:

B является параметр, который измеряется экспериментально. В этой работе, временные ряды изображения рецепторов FGFR1 на плазменной мембране клеток HeLa захвачены tIRF микроскопии и средняя кажущаяся яркость, B, определяется анализом N и B. Затем, после добавления FGF2, последовательные временные ряды фиксируются, чтобы следить за изменениями в самосборке молекул рецепторов на поверхности мембраны после стимуляции рецептора каноническим лигандой.

Однако, поскольку детектором микроскопа TIRF является камера EMCCD, выражение видимой яркости должно быть изменено как^19:

где смещение является смещение интенсивности обнаружения электроники, что является характерной для настроек детектора. Дисперсия и средняя интенсивность для аналогового детектора, соответственно, даются:

где G является аналоговым увеличением в цифровых уровнях (DL/фотоны), S, цифровые уровни на фотон¹⁹, дается наклон интенсивности против дисперсии участка для источника света с постоянной интенсивностью (без временных колебаний). Коэффициент q связан с формой объема обнаружения пикселей. По данным Hassler et al.³², коэффициент q равен 0,3 для tIRF изображения, работающего при максимальном выигрыше камеры обнаружения¹⁹. Параметры смещения, S и G являются характеристиками камеры и микроскопа. Очевидная яркость, B, получена путем перестановки eq. 11 в соответствии с eq. 12 и 13:

Экспериментально, является сложной функцией интенсивности лазера и эффективности обнаружения системы. Тем не менее, поскольку B/S линейно зависит от К, важно определить только относительную стоимость к для данного режима обнаружения:

где « пропорционально К. Тем не менее, калибровка выполняется с помощью внутренней ссылки.

Protocol

1. Подготовка образцов День 1. Семена HeLa клетки в полной среде в концентрации 100000-200000 клеток / мл в стеклянно-нижней посуды. Семена 6-8 реплицировать блюда.ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере среда дополняется 10% теплоинактивированной сывороткой плода (FBS), 1 мМ пируватом натрия, 100 U/100…

Representative Results

Результаты по двум репрезентативным клеткам HeLa-mEGFP-FGFR1, посеянным в одной и той же культуре, показаны на рисунке 5 и дополнительной таблице 1. Две клетки были захвачены в то время 0 мин(рисунок 5A, сверху) и 7 мин(?…

Discussion

Н ЗБи требует нескольких мер предосторожности при выборе модели ячейки и стратегии маркировки. Он может быть применен только к живым клеткам, которые остаются пристежными во время захвата изображения. Дополнительные колебания из-за всего жесткого смещения ячейки могут быть обработан?…

Materials

3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100×1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	21063029	Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10566-016	Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Biowest, Nuaillé, France	X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2	TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10270106	10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes	MatTek, Ashland, MA, USA	P35G-0.170-14-C	uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells	Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany	CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software	Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK		This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b	The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA		download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x	Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA	LONZA 17-602E	supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector	Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy		Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2	PeproTech EC, Ltd., London, UK		Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO	ThermoFisher Scientific	11360070	1mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent	MirusBio LLC, Madison, WI, USA	MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	25200056
Type F Immersion liquid 10 mL	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	AM2618	0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections