Dinâmica de oligomerização dos receptores de superfície celular em células vivas pela microscopia de fluorescência de reflexão interna total combinada com análise de número e brilho

Summary

Descrevemos uma abordagem de imagem para a determinação do estado oligomérico médio de oligomeros de receptores marcados por mEGFP induzidos pela ligação de ligand na membrana plasmática das células vivas. O protocolo é baseado na microscopia de Fluorescência Total de Reflexão Interna (TIRF) combinada com análise de Número e Brilho (N&B).

Abstract

Apesar da importância e ubiquidade da oligomerização do receptor, poucos métodos são aplicáveis para detectar eventos de agrupamento e medir o grau de agrupamento. Aqui, descrevemos uma abordagem de imagem para determinar o estado oligomérico médio de homocomplexos do receptor marcado pelo mEGFP na membrana das células vivas. O protocolo é baseado na microscopia de Fluorescência Total de Reflexão Interna (TIRF) combinada com análise de Número e Brilho (N&B). A N&B é um método semelhante à espectroscopia fluorescência-correlação (FCS) e fótons contando histograma (PCH), que são baseados na análise estatística das flutuações da intensidade da fluorescência da fluorofia difundindo dentro e fora de uma iluminação volume durante um tempo de observação. Em particular, a N&B é uma simplificação da PCH para obter informações sobre o número médio de proteínas em misturas oligoméricas. As amplitudes da flutuação da intensidade são descritas pelo brilho molecular do fluorophore e pelo número médio de fluorophores dentro do volume da iluminação. Assim, a N&B considera apenas o primeiro e segundo momentos da distribuição de amplitude, ou seja, a intensidade média e a variação. Esta é, ao mesmo tempo, a força e a fraqueza do método. Como apenas dois momentos são considerados, a N&B não pode determinar a fração molar de oligomeros desconhecidos em uma mistura, mas estima apenas o estado médio de oligomerização da mistura. No entanto, ele pode ser aplicado a séries de tempo relativamente pequenas (em comparação com outros métodos de momento) de imagens de células vivas em uma base pixel-a-pixel, simplesmente monitorando as flutuações de tempo da intensidade da fluorescência. Ele reduz o tempo eficaz por pixel para alguns microssegundos, permitindo a aquisição no intervalo de tempo de segundos a milissegundos, o que é necessário para cinética de oligomerização rápida. Finalmente, grandes áreas celulares, bem como compartimentos subcelulares podem ser explorados.

Introduction

Descrevemos uma abordagem de imagem total de reflexão interna fluorescência-número e brilho (TIRF-N&B) para determinar o estado oligomérico médio das moléculas receptoras na membrana plasmática das células vivas, com o objetivo de vincular a montagem do receptor dinâmica para a função biológica das proteínas (Figura 1).

Após a ligação extracelular do ligand, os receptores iniciam a transdução de sinal intracelular dependendo de sua conformação, oligomerização, potenciais co-receptores e composição da membrana. Apesar da importância e ubiquidade da oligomerização do receptor, reconhecida como um evento-chave na sinalização celular^{1,2,3,4,5,6, 7,}poucos métodos podem detectar eventos de agrupamento e medir o grau de agrupamento experimentalmente^8,9. O volume confocal (x, y – 300 nm, z 900 nm) é insuficientemente resolvido para provar a interação molecular e stoichiometria, mesmo após a otimização por algoritmos de restauração de imagem¹⁰. A composição sub-unitária de oligomeros proteicos não pode ser resolvida de forma puramente espacial, mesmo por métodos de super-resolução em x,y resolução de 20-70 nm, como PALM¹¹, STORM^12,e STED¹³. Além disso, sua resolução temporal (na ordem dos minutos por imagem) não pode seguir a cinética na faixa de segundos. Único molécula passo-branqueamento resolve a stoichiometria de oligomeros de proteína apenas se eles são imóvel¹⁴.

Um dos métodos mais versáteis para medir a densidade e o oligomerização de proteínas fluorescentes marcadas dentro de imagens individuais é a análise de distribuição de intensidade espacial (SpIDA), que depende da amostragem espacial. É aplicável a células quimicamente fixas e vivas, e permite a análise de várias regiões de interesse da célula simultaneamente usando microscopia fluorescência padrão¹⁵. Alternativamente, métodos momentâneos, como espectroscopia fluorescência-correlação (FCS)^16,fótons contando histograma (PCH)¹⁷, e Número e Brilho (N&B)^18,19, são adequados para oligomer quantitativo Medidas. Esses métodos analisam as flutuações de intensidade da fluorescência que podem ser observadas no tempo em que os fluorofforas se difundem dentro e fora de um volume de iluminação. As amplitudes das flutuações de intensidade podem ser descritas exclusivamente pelo brilho molecular do fluorofforre (ε) e pelo número médio de fluorofônicos (n) dentro do volume de iluminação¹⁷ (Figura 2). Normalmente, o coeficiente de difusão dos fluorofforos e o número médio de moléculas (inversamente relacionadas ao valor G(0) dentro do volume de iluminação podem ser obtidos pela FCS²⁰. No entanto, uma vez que o tempo de difusão apenas escalas com a raiz cúbica da massa, FCS não é suficientemente sensível para detectar alterações na massa molecular²¹. Na prática, a FCS de cor única não consegue detectar a dimerização dos receptores de membrana. PCH resolve misturas de diferentes oligomeros com precisão. Usando mais de dois momentos da distribuição da amplitude, detecta moléculas do brilho diferente que ocupam o mesmo volume da iluminação. Digitalização FCS²² e desenvolvimentos, como a interessante par-correlação de brilho molecular (pCOMB) abordagem²³, introduzido para estender a gama de aplicabilidade dos métodos de correlação fluorescência em sistemas biológicos²⁴ , permanecem métodos de ponto único sem a capacidade de medições rápidas em uma grande área de uma célula, exigindo muitas observações consecutivas em cada pixel e aquisição de dados na ordem de segundos.

A N&B é uma versão simplificada do PCH que considera apenas o primeiro e segundo momentos da amplitude da distribuição de fluorescência, ou seja, a intensidade média, e a variação, σ² (Figura 2)^18,19 e, por causa disso, não pode determinar a fração molar de oligomeros desconhecidos em uma mistura, mas estima somente o estado médio do oligomerization da mistura. No entanto, a N&B tem a vantagem de trabalhar com uma série de imagens de imagens de células vivas relativamente menores do que a PCH em uma base pixel-a-pixel, simplesmente monitorando as flutuações no tempo da intensidade da fluorescência. Como a N&B reduz o tempo por pixel para alguns microssegundos, ela pode seguir cinética de oligomerização rápida sobre grandes áreas celulares, permitindo a aquisição de imagem em uma escala de tempo de segundos em microscopia de varredura de raster (por exemplo, confocal, 2 fótons) e milissegundos em microscopia baseada em câmera (por exemplo, TIRFM).

Vários relatos demonstraram a capacidade da N&B de quantificar o número de subunidades em aglomerados de proteínas por meio de imagens de regiões celulares estendidas. Os clusters Paxillin-EGFP foram detectados nos locais de adesão nas células CHO-K1^25,e a agregação intracelular do peptídeo httex1p patogênico foi descrita nas células COS-7²⁶. A N&B foi aplicada para seguir a oligomerização ativa da ligand do receptor^{ErbB 27,}e o efeito do ligand FGF21 em Klothob (KLB) e fgfr1c em células^{HeLa 28}. A combinação de imagens tirf e análise de N&B foi usada para mostrar que a dinamina-2 é principalmente tetramérica em toda a membrana celular²⁹. Aplicamos a N&B a imagens de varredura de raster e TIRF para provar a dimerização conduzida por ligand dos receptores de membrana celular uPAR e FGFR1^30,31.

Métodos de correlação de fluorescência, como N&B, FCS e PCH, são baseados na noção de que, em um volume aberto, o número de bolhas de partículas segue uma distribuição de Poisson. Como somente os fótons que os fluorofônicos emitem podem ser detectados, o valor médio para uma intensidade de fluorescência medida versus o tempo em um pixel da imagem, é o produto do número médio de fluorofosforas no volume de iluminação, n, e sua brilho molecular, ε¹⁷:

onde o ε é expresso como o número de fótons emitidos por unidade de tempo (convencionalmente por segundo) por molécula quando a molécula está no centro do volume de iluminação.

O brilho é propriedade de cada fluorofofóbico em uma determinada aquisição criada, enquanto a intensidade é a soma de todas as contribuições de todos os fluorofos. Em competições biológicas, o brilho aumentará com o aumento do número de fluorofos que flutuam junto, dando a informação no estado do oligomerization da proteína fluorescente-etiquetada. As amplitudes de flutuação em um determinado pixel é medido a partir da variação do sinal de fluorescência, σ²:

Onde a média do quadrado de intensidade, e o quadrado da média de intensidade, são computados a partir dos valores de intensidade individual em cada pixel de cada quadro:

onde K é o número de quadros totais na série de tempo. Experimentalmente, é necessário calcular para toda a série de imagens a variação que descreve a dispersão dos valores de intensidade individual em cada pixel de uma única imagem em torno do valor de intensidade média. A variação inclui todas as flutuações de diferentes origens. Em uma primeira aproximação, a variação devido às partículas de difusão no volume de iluminação, σ²_0,pode ser separada da variância devido ao ruído do tiro do detector, σ²_d. As duas variações são independentes; assim, a variação total é dada por sua soma:

A variação, devido a flutuações moleculares dentro e fora do volume de detecção, é linearmente dependente do brilho e intensidade moleculares:

Reorganizando eq. 6 de acordo com o eq. 1:

De acordo com o conceito típico de espectroscopia de correlação de fluorescência, a equação 7 afirma que a variação devido ao número de flutuações depende do quadrado do brilho das partículas.

Em seguida, a variação devido às flutuações do detector é uma função linear da intensidade detectada, a suposição de que o detector é operado abaixo de seu limite de saturação¹⁹:

No caso dos detectores de contagem de fótons =1e c=0, assim a variação do detector é igual à intensidade média:

Para aplicar esses conceitos a medições reais em células vivas, Gratton e colegas¹⁸ definem o brilho aparente, B, para cada pixel como a proporção da variação sobre a intensidade média:

B é o parâmetro que é medido experimentalmente. Neste trabalho, imagens de séries de tempo de receptores FGFR1 na membrana plasmática das células HeLa são capturadas pela microscopia TIRF e o brilho aparente médio, B, é determinado pela análise de N&B. Então, após a adição de FGF2, séries de tempo consecutivos são capturadas para acompanhar as mudanças na auto-montagem das moléculas receptoras na superfície da membrana após a estimulação do receptor com o ligand canônico.

No entanto, uma vez que o detector do microscópio TIRF é uma câmera EMCCD, a expressão para o brilho aparente precisa ser modificada como¹⁹:

onde o deslocamento é o deslocamento da intensidade da eletrônica da deteção que é uma característica das ajustes do detetor. A variação e a intensidade média de um detector analógico são, respectivamente, dadas por:

onde G é o ganho analógico em níveis digitais (DL/fótons), S, os níveis digitais por fóton¹⁹, é dado pela inclinação de uma intensidade versus variação parcela para uma fonte de luz com intensidade constante (sem flutuações temporais). O fator γ está relacionado à forma do volume de detecção de pixels. De acordo com Hassler et al.^32,o fator γ é igual a 0,3 para imagens TIRF trabalhando no ganho máximo da câmera de detecção¹⁹. Os parâmetros de deslocamento, S e G são características da câmera e do microscópio. O brilho aparente, B, é obtido reorganizando eq. 11 de acordo com eq. 12 e 13:

Experimentalmente, o ε é uma função complexa da intensidade do laser e da eficiência de detecção do sistema. No entanto, uma vez que B / S é linearmente dependente de ε, só é importante determinar o valor relativo do ε para um determinado modo de detecção:

onde o ε’ é proporcional ao ε. Ainda assim, uma calibração é realizada usando uma referência interna.

Protocol

1. Preparação da amostra Dia 1. Células HeLa semente em meio completo em uma concentração de 100.000-200.000 células / mL em pratos de fundo de vidro. Sementes 6-8 replicar pratos.Nota: Neste exemplo, o meio é complementado com 10% de calor inativado Fetal Bovine Serum (FBS), 1 mM piruvado de sódio, 100 U/100 μg penicilina/estreptomicina. Vários pratos de replicar são preparados. Dia 2-3. Quando as células estão em sub-confluência, transfect metade dos pratos com o p…

Representative Results

Os resultados de duas células representativas HeLa-mEGFP-FGFR1 semeadas no mesmo prato cultural são mostrados na Figura 5 e na Tabela Suplementar 1. As duas células foram capturadas no tempo 0 min(Figura 5A, superior) e 7 min(Figura 5A, inferior) após a adição do ligand FGF2. <strong …

Discussion

A N&B requer várias precauções na escolha do modelo celular e da estratégia de rotulagem. Ele pode ser aplicado apenas para células vivas que permanecem aderidas de forma enova durante o tempo de captura de imagem. Flutuações extras devido ao deslocamento rígido de toda a célula podem ser tratadas com abordagens adequadas de restauração de imagem^38. No entanto, geralmente quando uma célula se move, a membrana celular também se deforma, e a deformação da estrutura, produzindo grande …

Materials

3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100×1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	21063029	Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10566-016	Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Biowest, Nuaillé, France	X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2	TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10270106	10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes	MatTek, Ashland, MA, USA	P35G-0.170-14-C	uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells	Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany	CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software	Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK		This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b	The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA		download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x	Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA	LONZA 17-602E	supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector	Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy		Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2	PeproTech EC, Ltd., London, UK		Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO	ThermoFisher Scientific	11360070	1mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent	MirusBio LLC, Madison, WI, USA	MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	25200056
Type F Immersion liquid 10 mL	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	AM2618	0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections