使用基于多反应监测的人类脑组织蛋白质的多反应监测工作流程定量蛋白质组学工作流程
Summary
该协议旨在引入使用三倍频谱仪进行临床样本蛋白质的多反应监测 （MRM）。我们提供了系统的工作流程，从样本准备到临床样本数据分析，并采取了所有必要的预防措施。
Abstract
过去十年来对人体脑组织的蛋白体分析极大地增进了我们对大脑的理解。然而，与大脑有关的疾病仍然是全世界死亡的主要原因，因此需要进一步了解其病理生物学。传统的抗体技术，如西式印迹或免疫造血术，除了劳动密集型、定性或半定量外，还具有低通量。即使是传统的基于质谱学的猎枪方法也未能提供确凿的证据来支持某种假设。有针对性的蛋白学方法主要是假设驱动的，与长期使用的常规猎枪蛋白学方法不同。多反应监测就是这样一种有针对性的方法，需要使用称为串联四倍质谱仪或三四倍质谱仪的特殊质谱仪。在目前的研究中，我们系统地强调了利用人脑组织成功实施基于四极谱的四极质谱系蛋白造影工作流程的主要步骤，目的是将这一工作流程引入更广泛的研究社区。
Introduction
在过去十年中，质谱学（MS）的迅速发展，加上对色谱技术的了解增加，极大地促进了基于MS的蛋白造影学的进步。分子生物学技术，如西式印迹和免疫造血术，长期以来一直遭受重复性问题，缓慢的周转时间，观察者间变异性，以及它们无法准确量化蛋白质，仅举几例。为此，高通量蛋白质学方法的优越灵敏度继续为分子生物学家提供一个替代和更可靠的工具，以寻求更好地了解蛋白质在细胞中的作用。然而，猎枪蛋白质学方法（数据依赖获取或DDA）往往不能检测复杂组织中低富含的蛋白质，除了严重依赖仪器的灵敏度和分辨率。在过去的几年里，世界各地的实验室一直在开发数据独立获取 （DIA） 等技术，这些技术需要更大的计算能力和可靠的软件来处理这些高度复杂的数据集。然而，这些技术仍然是一个工作正在进行中，不是很用户友好。有针对性的基于MS的蛋白学方法在MS方法的高吞吐量性质和像ELISA这样的分子生物学方法的敏感性之间提供了完美的平衡。一个有针对性的质谱为基础的蛋白质解毒学实验侧重于检测假说驱动的蛋白质或肽从发现为基础的猎枪蛋白质学实验或通过可用文献1，2。多反应监测 （MRM） 是一种有针对性的 MS 方法，它使用串联四倍体质谱仪从复杂样品中准确检测和量化蛋白质/肽。尽管需要使用低分辨率仪器，但该技术仍具有更高的灵敏度和特异性。
四极体由 4 个平行杆制成，每根杆与对角对角线杆相连。通过应用交替射频和直流电压，在四极杆之间创建一个波动场。四极内离子的轨迹受相反杆上相同电压的存在影响。通过将射频施加到直流电压上，离子的轨迹可以稳定下来。正是这种四倍体的特性，允许它被用作质量过滤器，可以选择性地让特定的离子通过。根据需要，四胞胎可以在静态模式或扫描模式下操作。静态模式只允许指定 m/z 的离子通过，使该模式具有高度选择性和特定于兴趣离子。另一方面，扫描模式允许整个 m/z 范围的离子通过。因此，串联四倍体质谱仪可以以4种可能的方式运行：（i） 第一个四胞胎在静态模式下运行，第二个四极在扫描模式下运行：ii） 第一个四胞胎在扫描模式下运行，而第二个四胞胎在静态模式下操作：iii） 两个四极在扫描模式下工作;和 iv） 两个四极在静态模式3中运行 。在典型的 MRM 实验中，四极两者均以静态模式运行，允许对碎片后的特定前体及其产生的产品进行监控。这使得该技术非常敏感和有选择性，允许精确量化。
对于分子生物学家来说，人类脑组织及其细胞是一个宝库。人体一个有趣的器官的这些显着单位可以提供分子和细胞洞察其功能。对脑组织的蛋白细胞学研究不仅可以帮助我们了解健康大脑的系统性功能，而且可以帮助我们了解某些疾病引起的细胞通路。然而，具有所有异质性的脑组织是一个非常复杂的器官来分析，需要一致的方法来更好地了解分子水平的变化。以下工作描述了整个工作流程，从从脑组织中提取蛋白质、创建和优化 MRM 检测方法到验证目标（图 1）。在这里，我们系统地强调了使用人脑组织进行成功的 MRM 实验的主要步骤，目的是向更广泛的研究社区介绍该技术及其挑战。
Protocol
Representative Results
Discussion
多年来，免疫化学和西式印迹等技术一直被认为是验证蛋白质靶点的黄金标准。即使在今天，这些方法也很少在协议中修改，而且很少依赖技术，这使得它们非常繁琐和乏味。除此之外，它们还涉及使用昂贵的抗体，这些抗体在批次中并不总是表现出相同的特异性，并且需要大量的专业知识。此外，只有一小部分使用质谱仪等高通量技术识别的蛋白质具有相容的抗体，使整个过程更加复杂。因此?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们承认MHRD-UAY项目（UCHHATAR AVISHKAR YOJANA），该项目#34_IITB在生物技术部的支持下，在孟买国际信息技术研究所（BT/PR13114/INF/206/206/2015）进行所有MS相关实验。
我们特别感谢里沙布·亚达夫先生制作和编辑了整个视频，并感谢尼尚特·内鲁卡尔先生在编辑音频方面的工作。
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| TSQ Altis mass spectrometer | Thermo | TSQ02-10002 | |
| uHPLC – Vanquish | Thermo | VQF01-20001 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 |
Referenzen
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