Quantitativer Proteomik-Workflow mit multipler Reaktionsüberwachung basierender Detektion von Proteinen aus menschlichem Hirngewebe
Summary
Das Protokoll zielt darauf ab, die Verwendung eines Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometers für die Mehrfachreaktionsüberwachung (MRM) von Proteinen aus klinischen Proben einzuführen. Wir haben einen systematischen Workflow von der Probenvorbereitung bis zur Datenanalyse für klinische Proben mit allen notwendigen Vorsichtsmaßnahmen bereitgestellt.
Abstract
Die proteomische Analyse des menschlichen Hirngewebes in den letzten zehn Jahren hat unser Verständnis des Gehirns erheblich verbessert. Gehirnbedingte Störungen sind jedoch weiterhin ein Hauptfaktor für Todesfälle auf der ganzen Welt, was ein noch besseres Verständnis ihrer Pathobiologie erfordert. Traditionelle Antikörper-basierte Techniken wie Western Blotting oder Immunhistochemie leiden unter niedrigem Durchsatz und sind arbeitsintensiv und qualitativ oder semi-quantitativ. Selbst konventionelle massenspektrometrische Schrotflintenansätze liefern keine schlüssigen Beweise für eine bestimmte Hypothese. Gezielte Proteomik-Ansätze sind weitgehend hypothesengetrieben und unterscheiden sich von den herkömmlichen Shotgun-Proteomik-Ansätzen, die seit langem verwendet werden. Die Überwachung mehrerer Reaktionen ist ein solcher gezielter Ansatz, der die Verwendung eines speziellen Massenspektrometers erfordert, das als Tandem-Quadrupol-Massenspektrometer oder Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer bezeichnet wird. In der aktuellen Studie haben wir systematisch die wichtigsten Schritte hervorgehoben, die mit der Durchführung eines erfolgreichen Tandem-Quadrupol-Massenspektrometrie-basierten Proteomik-Workflows mit menschlichem Hirngewebe verbunden sind, mit dem Ziel, diesen Workflow einer breiteren Forschungsgemeinschaft vorzustellen.
Introduction
In den letzten zehn Jahren haben schnelle Entwicklungen in der Massenspektrometrie (MS) in Verbindung mit einem besseren Verständnis der Chromatographietechniken wesentlich zur Weiterentwicklung der MS-basierten Proteomik beigetragen. Molekularbiologische Techniken wie Western Blotting und Immunhistochemie leiden seit langem unter Reproduzierbarkeitsproblemen, langsamer Durchlaufzeit, Variabilität zwischen Beobachtern und ihrer Unfähigkeit, Proteine genau zu quantifizieren, um nur einige zu nennen. Zu diesem Zweck bietet die überlegene Empfindlichkeit von Hochdurchsatz-Proteomik-Ansätzen Molekularbiologen weiterhin ein alternatives und zuverlässigeres Werkzeug, um die Rolle von Proteinen in Zellen besser zu verstehen. Schrotflinten-Proteomik-Ansätze (Data Dependent Acquisition oder DDA) können jedoch oft keine proteinarmen Proteine in komplexen Geweben nachweisen und sind stark von der Empfindlichkeit und Auflösung des Instruments abhängig. In den letzten Jahren haben Labore auf der ganzen Welt Techniken wie Data Independent Acquisition (DIA) entwickelt, die eine erhöhte Rechenleistung und zuverlässige Software erfordern, die mit diesen hochkomplexen Datensätzen umgehen kann. Diese Techniken sind jedoch noch in Arbeit und nicht sehr benutzerfreundlich. Gezielte MS-basierte Proteomik-Ansätze bieten eine perfekte Balance zwischen dem hohen Durchsatz von MS-Ansätzen und der Sensitivität molekularbiologischer Ansätze wie ELISA. Ein gezieltes massenspektrometriebasiertes Proteomik-Experiment konzentriert sich auf den Nachweis hypothesengetriebener Proteine oder Peptide aus entdeckungsbasierten Shotgun-Proteomik-Experimenten oder durch verfügbare Literatur1,2. Multiple Reaction Monitoring (MRM) ist ein solcher gezielter MS-Ansatz, der ein Tandem-Quadrupol-Massenspektrometer zum genauen Nachweis und zur Quantifizierung von Proteinen / Peptiden aus komplexen Proben verwendet. Die Technik bietet eine höhere Empfindlichkeit und Spezifität, obwohl ein Gerät mit niedriger Auflösung erforderlich ist.
Ein Quadrupol besteht aus 4 parallelen Stäben, wobei jede Stange mit der diagonal gegenüberliegenden Stange verbunden ist. Zwischen den Quadrupolstäben entsteht durch Anlegen von wechselalten HF- und Gleichspannungen ein schwankendes Feld. Die Flugbahn der Ionen im Quadrupol wird durch das Vorhandensein der gleichen Spannungen über gegenüberliegende Stäbe beeinflusst. Durch Anlegen der HF-DC-Spannung kann die Flugbahn der Ionen stabilisiert werden. Es ist diese Eigenschaft des Quadrupols, die es ermöglicht, ihn als Massenfilter zu verwenden, der selektiv bestimmte Ionen passieren lassen kann. Je nach Bedarf kann ein Quadrupol entweder im statischen Modus oder im Scan-Modus betrieben werden. Der statische Modus lässt nur Ionen mit einem bestimmten m / z passieren, was den Modus sehr selektiv und spezifisch für das interessierene Ion macht. Der Scan-Modus hingegen lässt Ionen über den gesamten m/z-Bereich passieren. So können Tandem-Quadrupol-Massenspektrometer auf 4 mögliche Arten arbeiten: i) der erste Quadrupol arbeitet im statischen Modus, während der zweite im Scanmodus arbeitet; ii) der erste Quadrupol arbeitet im Scanmodus, während der zweite im statischen Modus arbeitet; iii) beide Quadruppole, die im Scanmodus arbeiten; und iv) beide Quadruppole, die im statischen Modus3arbeiten. In einem typischen MRM-Experiment arbeiten beide Quadrupolen im statischen Modus, so dass spezifische Vorläufer und ihre resultierenden Produkte nach der Fragmentierung überwacht werden können. Dies macht die Technik sehr empfindlich und selektiv und ermöglicht eine genaue Quantifizierung.
Für Molekularbiologen sind das menschliche Hirngewebe und seine Zellen eine Fundgrube. Diese bemerkenswerten Einheiten eines immer interessanten Organs des menschlichen Körpers können molekulare und zelluläre Einblicke in seine Funktionsweise liefern. Proteomische Untersuchungen des Hirngewebes können uns nicht nur helfen, die systemische Funktion eines gesunden Gehirns zu verstehen, sondern auch die zellulären Bahnen, die durch eine Krankheit dysreguliert werden4. Das Hirngewebe mit all seiner Heterogenität ist jedoch ein sehr komplexes zu analysierendes Organ und erfordert einen konzertierten Ansatz zum besseren Verständnis der Veränderungen auf molekularer Ebene. Die folgende Arbeit beschreibt den gesamten Arbeitsablauf von der Extraktion von Proteinen aus Hirngewebe über die Erstellung und Optimierung der Methoden für den MRM-Assay bis hin zur Validierung der Targets (Abbildung 1). Hier haben wir systematisch die wichtigsten Schritte eines erfolgreichen MRM-basierten Experiments mit menschlichem Hirngewebe hervorgehoben, mit dem Ziel, die Technik und ihre Herausforderungen einer breiteren Forschungsgemeinschaft vorzustellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Techniken wie Immunhistochemie und Western Blotting galten viele Jahre lang als Goldstandards für die Validierung von Proteinzielen. Diese Methoden finden auch heute noch Anwendung mit geringfügigen Änderungen im Protokoll und wenig Abhängigkeit von der Technologie, was sie sehr umständlich und mühsam macht. Darüber hinaus beinhalten sie auch den Einsatz teurer Antikörper, die nicht immer die gleiche Spezifität über Chargen hinweg aufweisen und viel Fachwissen erfordern. Darüber hinaus verfügt nur ein kleine…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem MHRD-UAY-Projekt (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), dem Projekt #34_IITB SS und massfiitB Facility am IIT Bombay, das vom Department of Biotechnology (BT / PR13114 / INF / 22 / 206 / 2015) unterstützt wird, um alle MS-bezogenen Experimente durchzuführen.
Wir danken Herrn Rishabh Yadav für die Erstellung und Bearbeitung des gesamten Videos und Herrn Nishant Nerurkar für seine Arbeit bei der Bearbeitung des Audios.
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| TSQ Altis mass spectrometer | Thermo | TSQ02-10002 | |
| uHPLC – Vanquish | Thermo | VQF01-20001 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 |
Referenzen
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