인간 뇌 조직에서 단백질의 다중 반응 모니터링 기반 검출을 이용한 정량적 프로테오믹스 워크플로우
Summary
이 프로토콜은 임상 샘플에서 단백질의 다중 반응 모니터링 (MRM)에 대한 트리플 쿼드러폴 질량 분광계의 사용을 소개하는 것을 목표로합니다. 우리는 샘플 준비에서 임상 샘플을 위한 데이터 분석에 이르기까지 필요한 모든 예방 조치를 취하도록 체계적인 워크플로우를 제공했습니다.
Abstract
지난 10 년 동안 인간의 뇌 조직의 proteomic 분석은 크게 뇌의 우리의 이해를 향상했다. 그러나, 두뇌 관련 무질서는 그들의 병리학의 더 중대한 이해를 위한 필요를 필요로 하는 세계 적인 죽음의 중요한 기여자가 계속합니다. 서양 블로팅 또는 면역 집중 화학과 같은 전통적인 항체 기반 기술은 노동 집약적이고 질적이거나 반정성인 것 외에 낮은 처리량으로 고통받습니다. 기존의 대량 분광계 기반 산탄총 접근법조차도 특정 가설을 뒷받침하는 결정적인 증거를 제공하지 못합니다. 표적 프로테오믹스 접근법은 대체로 가설이 주도되며 오랫동안 사용되어 온 기존의 산탄총 프로테오믹스 접근법과 다릅니다. 다중 반응 모니터링은 탠덤 쿼드러폴 질량 분광계 또는 삼중 사중극 질량 분광계라고 불리는 특수 질량 분광계의 사용을 요구하는 이러한 표적 접근법 중 하나입니다. 현재 연구에서는, 우리는 체계적으로 더 넓은 연구 커뮤니티에이 워크 플로우를 소개하는 것을 목표로 인간의 뇌 조직을 사용하여 성공적인 탠덤 쿼드러폴 질량 분광학 기반 프로테오믹스 워크플로우를 수행하는 데 관련된 주요 단계를 강조했다.
Introduction
지난 10년 동안 크로마토그래피 기술에 대한 이해가 증가함에 따라 질량 분석법(MS)의 급속한 발전은 MS 기반 프로테오믹스의 발전에 크게 도움이 되었습니다. 서양 블로팅 및 면역 조직 화학과 같은 분자 생물학 기반 기술은 오랫동안 재현성 문제, 느린 소요 시간, 관찰자 간 가변성 및 단백질을 정확하게 정량화할 수 없는 것으로 인해 몇 가지 이름을 지정했습니다. 이를 위해, 고처리량 프로테오믹스 접근법의 우수한 감도는 분자 생물학자에게 세포에서 단백질의 역할을 더 잘 이해하기 위해 그들의 탐구에 있는 대체되고 더 신뢰할 수 있는 공구를 계속 제공하고 있습니다. 그러나 산탄총 프로테오믹스접근법(데이터 의존적 인수 또는 DDA)은 기기의 민감성과 해상도에 크게 의존하는 것 외에도 복잡한 조직에서 낮은 풍부한 단백질을 검출하지 못합니다. 지난 몇 년 동안 전 세계 실험실은 이러한 매우 복잡한 데이터 집합을 처리할 수 있는 컴퓨팅 성능과 신뢰할 수 있는 소프트웨어가 필요한 데이터 독립 획득(DIA)과 같은 기술을 개발해 왔습니다. 그러나 이러한 기술은 여전히 진행 중인 작업이며 사용자 친화적이지 않습니다. 표적 MS 기반 프로테오믹스 접근법은 MS 접근법의 높은 처리량 특성과 ELISA와 같은 분자 생물학 접근법의 감도 사이의 완벽한 균형을 제공합니다. 표적 질량 분광계 계 프로테오믹스 실험은 발견 기반 산탄총 프로테오믹스 실험또는 사용 가능한 문헌1,2를통해 가설 구동 단백질 또는 펩티드를 검출하는 데 중점을 둡니다. 다중 반응 모니터링(MRM)은 복잡한 시료로부터 단백질/펩타이드의 정확한 검출 및 정량화를 위해 탠덤 쿼드러폴 질량 분광계를 사용하는 이러한 표적 MS 접근법 중 하나입니다. 이 기술은 저해상도 계측기를 사용해야함에도 불구하고 더 높은 감도와 특이성을 제공합니다.
쿼드러폴은 4개의 평행 막대로 만들어졌으며 각 막대는 대각선 반대 막대에 연결됩니다. 교대RF 와 DC 전압을 적용하여 쿼드러폴 로드 사이에 변동 필드가 생성됩니다. 쿼드러폴 내부의 이온의 궤적은 반대 막대에 걸쳐 동일한 전압의 존재에 의해 영향을받습니다. RF를 DC 전압에 적용함으로써 이온의 궤적을 안정화할 수 있습니다. 특정 이온을 선택적으로 통과할 수 있는 질량 필터로 사용할 수 있는 쿼드러폴의 이 특성입니다. 필요에 따라 쿼드러폴을 정적 모드 또는 스캐닝 모드에서 작동할 수 있습니다. 정적 모드는 지정된 m/z가 있는 이온만 통과할 수 있으므로 이 모드는 이온에 매우 선택적이고 특정합니다. 반면에 스캐닝 모드는 전체 m/z 범위에 걸쳐 이온이 통과할 수 있도록 합니다. 따라서, 탠덤 쿼드러폴 질량 분광기는 4가지 가능한 방법으로 작동할 수 있다: i) 제1 쿼드러폴은 스캐닝 모드에서 두 번째 동작하는 동안 정적 모드에서 작동; ii) 두 번째 동작이 정적 모드에서 작동하는 동안 스캐닝 모드에서 작동하는 첫 번째 쿼드러폴; iii) 스캔 모드에서 작동하는 두 쿼드러폴; 및 iv) 정적 모드3에서작동하는 두 쿼드러폴. 일반적인 MRM 실험에서 쿼드러폴은 정적 모드에서 작동하므로 단편화 후 특정 전구체와 생성된 제품을 모니터링할 수 있습니다. 이것은 정확한 정량화를 허용하는 기술을 매우 민감하고 선택적으로 만듭니다.
분자 생물학자들에게 인간의 뇌 조직과 세포는 보물 창고입니다. 인체의 항상 흥미로운 기관의 이 놀라운 단위는 그것의 기능에 분자 및 세포 통찰력을 제공할 수 있습니다. 뇌 조직의 Proteomic 조사는 우리가 건강한 두뇌의 전신 기능을 이해하는 것을 도울 뿐 아니라 또한 몇몇 질병에 의해 가해질 때 dysregulated를 얻는 세포 통로를 이해하는 것을 도울 수 있습니다4. 그러나, 모든 이질성을 가진 두뇌 조직은 분석하기 위하여 아주 복잡한 기관이고 분자 수준에서 변경의 더 나은 이해를 위한 공동 접근을 요구합니다. 다음 작품은 뇌 조직에서 단백질을 추출하고 MRM 분석 방법을 생성 및 최적화하는 것부터 표적의 유효성검사(그림 1)에이르기까지 전체 워크플로우를 설명합니다. 여기에서, 우리는 체계적으로 더 넓은 연구 지역 사회에 기술과 그 도전을 소개하는 것을 목적으로 인간 두뇌 조직을 사용하여 성공적인 MRM 기지를 둔 실험에 관련시킨 중요한 단계를 강조했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
면역 히스토케와 서양 얼룩같은 기술은 수년 동안 단백질 표적의 검증을 위한 금 표준으로 여겨졌습니다. 이러한 방법은 프로토콜의 사소한 수정과 기술에 대한 의존도가 거의 없어 오늘날에도 사용이 매우 번거롭고 지루합니다. 이 외에도, 그들은 또한 항상 배치에 걸쳐 동일한 특이성을 표시하지 않고 전문 지식의 큰 거래를 필요로 비싼 항체의 사용을 포함한다. 추가적으로, 질량 분석과 같은…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 MHRD-UAY 프로젝트 (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), 생명 공학부 (BT / PR13114 / INF / 22/206/2015)가 지원하는 IIT 봄베이의 SS 및 MASSFIITB 시설에 대한 프로젝트 #34_IITB 모든 MS 관련 실험을 수행하도록 인정합니다.
전체 비디오 제작 및 편집을 위한 리샤브 야다브 씨와 오디오 편집 작업을 위한 Nishant Nerurkar 씨에게 특별한 감사를 드립니다.
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| TSQ Altis mass spectrometer | Thermo | TSQ02-10002 | |
| uHPLC – Vanquish | Thermo | VQF01-20001 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 |
Referenzen
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