Kwantitatieve Proteomics Workflow met behulp van multiple reaction monitoring gebaseerde detectie van eiwitten uit menselijk hersenweefsel
Summary
Het protocol is bedoeld om het gebruik van een triple quadrupole mass spectrometer voor Multiple Reaction Monitoring (MRM) van eiwitten uit klinische monsters in te voeren. We hebben een systematische workflow voorzien, van monstervoorbereiding tot gegevensanalyse voor klinische monsters met alle nodige voorzorgsmaatregelen die moeten worden genomen.
Abstract
De proteomische analyse van het menselijk hersenweefsel in de afgelopen tien jaar heeft ons begrip van de hersenen aanzienlijk verbeterd. Hersengerelateerde aandoeningen blijven echter een belangrijke bijdrage leveren aan sterfgevallen over de hele wereld, waardoor de behoefte aan nog meer begrip van hun pathobiologie noodzakelijk is. Traditionele op antilichamen gebaseerde technieken zoals westerse blotting of immunohistochemie lijden aan een lage doorvoer, naast arbeidsintensief en kwalitatief of semi-kwantitatief. Zelfs conventionele massaspectrometrie-gebaseerde shotgun benaderingen leveren geen sluitend bewijs om een bepaalde hypothese te ondersteunen. Gerichte proteomics benaderingen zijn grotendeels hypothese gedreven en verschillen van de conventionele shotgun proteomics benaderingen die al lang in gebruik zijn. Meervoudige reactiebewaking is zo’n gerichte aanpak die het gebruik van een speciale massaspectrometer vereist, de tandemviervoudige massaspectrometer of drievoudige viervoudige massaspectrometer. In de huidige studie hebben we systematisch de belangrijkste stappen benadrukt die gepaard gaan met het uitvoeren van een succesvolle tandemviervoudige op massaspectrometrie gebaseerde proteomics-workflow met behulp van menselijk hersenweefsel met als doel deze workflow te introduceren in een bredere onderzoeksgemeenschap.
Introduction
In de afgelopen tien jaar hebben snelle ontwikkelingen in massaspectrometrie (MS) in combinatie met een beter begrip van chromatografietechnieken sterk bijgedragen aan de vooruitgang van op MS gebaseerde proteomica. Moleculaire biologie-gebaseerde technieken zoals westerse blotting en immunohistochologie hebben lang geleden aan reproduceerbaarheidsproblemen, trage doorlooptijd, variabiliteit tussen waarnemers en hun onvermogen om eiwitten nauwkeurig te kwantificeren, om er maar een paar te noemen. Daartoe blijft de superieure gevoeligheid van proteomics-benaderingen met hoge doorvoer moleculair biologen een alternatief en betrouwbaarder hulpmiddel bieden in hun zoektocht naar een beter begrip van de rollen van eiwitten in cellen. Echter, shotgun proteomics benaderingen (Data dependent Acquisition of DDA) vaak niet te detecteren lage overvloedige eiwitten in complexe weefsels naast sterk afhankelijk van de gevoeligheid en resolutie van het instrument. In de afgelopen jaren hebben laboratoria over de hele wereld technieken ontwikkeld zoals Data Independent Acquisition (DIA) die meer rekenkracht en betrouwbare software vereisen die deze zeer complexe datasets aankan. Deze technieken zijn echter nog steeds een werk in uitvoering en niet erg gebruiksvriendelijk. Gerichte MS-gebaseerde proteomics-benaderingen bieden een perfecte balans tussen de hoge doorvoer van MS-benaderingen en de gevoeligheid van moleculaire biologiebenaderingen zoals ELISA. Een gericht op massaspectrometrie gebaseerd proteomics-experiment richt zich op het detecteren van hypothesegestuurde eiwitten of peptiden uit op ontdekking gebaseerde proteomics-experimenten of via beschikbare literatuur1,2. Multiple Reaction Monitoring (MRM) is zo’n gerichte MS-benadering die een tandemviervoudige massaspectrometer gebruikt voor nauwkeurige detectie en kwantificering van eiwitten /peptiden uit complexe monsters. De techniek biedt een hogere gevoeligheid en specificiteit, ondanks het gebruik van een instrument met lage resolutie.
Een viervoeter is gemaakt van 4 parallelle staven, waarbij elke staaf is verbonden met de diagonaal tegenoverliggende staaf. Tussen de viervoudige staven ontstaat een fluctuerend veld door afwisselend RF- en DC-spanningen toe te passen. De baan van de ionen in de viervoeter wordt beïnvloed door de aanwezigheid van dezelfde spanningen over tegenovergestelde staven. Door de RF op gelijkspanning aan te brengen, kan het traject van de ionen worden gestabiliseerd. Het is deze eigenschap van de viervoeter die het mogelijk maakt om te worden gebruikt als een massafilter dat selectief specifieke ionen kan laten passeren. Afhankelijk van de behoefte kan een quadrupole worden bediend in de statische modus of de scanmodus. De statische modus laat alleen ionen met een gespecificeerde m/z door, waardoor de modus zeer selectief en specifiek is voor het ion van belang. De scanmodus daarentegen laat ionen over het hele m/z-bereik passeren. Tandemviervoudige massaspectrometers kunnen dus op 4 mogelijke manieren werken: i) de eerste viervoeter werkt in de statische modus terwijl de tweede in scanmodus werkt; ii) de eerste viervoeter die in de scanmodus werkt, terwijl de tweede in de statische modus werkt; iii) beide quadrupoles die in de scanmodus werken; en iv) beide viervoeters die in statische modus werken3. In een typisch MRM-experiment werken beide quadrupolen in de statische modus, waardoor specifieke precursoren en de daaruit voortvloeiende producten na fragmentatie kunnen worden gecontroleerd. Dit maakt de techniek zeer gevoelig en selectief waardoor nauwkeurige kwantificering mogelijk is.
Voor moleculair biologen zijn het menselijk hersenweefsel en zijn cellen een schatkamer. Deze opmerkelijke eenheden van een steeds interessanter orgaan van het menselijk lichaam kunnen moleculaire en cellulaire inzichten geven in de werking ervan. Proteomische onderzoeken van het hersenweefsel kunnen ons niet alleen helpen de systemische werking van een gezond brein te begrijpen, maar ook de cellulaire paden die ontregeld raken wanneer ze worden toegebracht door een ziekte4. Het hersenweefsel met al zijn heterogeniteit is echter een zeer complex orgaan om te analyseren en vereist een gecoördineerde aanpak voor een beter begrip van de veranderingen op moleculair niveau. Het volgende werk beschrijft de hele workflow, beginnend met het extraheren van eiwitten uit hersenweefsel, het creëren en optimaliseren van de methoden voor MRM-test, tot validatie van de doelen (Figuur 1). Hier hebben we systematisch de belangrijkste stappen benadrukt die betrokken zijn bij een succesvol MRM-gebaseerd experiment met menselijk hersenweefsel met als doel de techniek en de uitdagingen ervan te introduceren in een bredere onderzoeksgemeenschap.
Protocol
Representative Results
Discussion
Technieken zoals immunohistochistry en westerse blotting werden beschouwd als de gouden normen voor validatie van eiwitdoelen voor vele jaren. Deze methoden vinden gebruik zelfs vandaag met kleine wijzigingen in het protocol en weinig afhankelijkheid van technologie waardoor ze zeer omslachtig en vervelend. Daarnaast gaat het ook om het gebruik van dure antilichamen die niet altijd dezelfde specificiteit vertonen in batches en veel expertise vereisen. Bovendien heeft slechts een klein deel van de eiwitten die zijn geïd…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We erkennen MHRD-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), project #34_IITB aan SS en MASSFIITB Facility bij IIT Bombay ondersteund door het Department of Biotechnology (BT/PR13114/INF/22/206/2015) om alle MS-gerelateerde experimenten uit te voeren.
We danken mr. Rishabh Yadav voor het maken en bewerken van de hele video en mr. Nishant Nerurkar voor zijn werk bij het bewerken van de audio.
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| TSQ Altis mass spectrometer | Thermo | TSQ02-10002 | |
| uHPLC – Vanquish | Thermo | VQF01-20001 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 |
Referenzen
- Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions. Nature Methods. , (2012).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).
- Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
- Hosp, F., Mann, M. A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience. Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).
- Scopes, R. K. Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm. Analytical Biochemistry. , (1974).
- Kusebauch, U., et al. Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome. Cell. , (2016).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).
- Escher, C., et al. Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides. Proteomics. , (2012).
- Gillette, M. A., Carr, S. A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry. Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).
- Whiteaker, J. R., et al. A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma. Nature Biotechnology. , (2011).
- Hüttenhain, R., et al. Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics. Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).
- Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).
- Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits Aβ aggregation and toxicity. Biochemie. , (2001).
- Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia. Journal of Neurochemistry. , (2012).
- Liu, L. Y., et al. Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases. PLoS ONE. , (2012).
- Abbatiello, S., et al. New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins. Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).
