Рабочий процесс количественной протеомики с использованием множественного мониторинга реакций на основе обнаружения белков из ткани мозга человека
Summary
Протокол направлен на введение использования тройного квадрупольного масс-спектрометра для мониторинга множественных реакций (MRM) белков из клинических образцов. Мы обеспечили систематический рабочий процесс, начиная от подготовки образцов до анализа данных для клинических образцов со всеми необходимыми мерами предосторожности.
Abstract
Протеомный анализ ткани человеческого мозга за последнее десятилетие значительно улучшил наше понимание мозга. Тем не менее, расстройства, связанные с мозгом, по-прежнему являются основной причиной смертей во всем мире, что требует еще большего понимания их патобиологии. Традиционные методы, основанные на антителах, такие как западное блоттинг или иммуногистохимия, страдают от низкой пропускной способности, помимо того, что они трудоемкие и качественные или полукоачественные. Даже обычные подходы, основанные на масс-спектрометрии, не могут предоставить убедительных доказательств в поддержку определенной гипотезы. Подходы к целенаправленной протеомике в значительной степени основаны на гипотезах и отличаются от обычных подходов к протеомике дробовика, которые давно используются. Мониторинг множественных реакций является одним из таких целевых подходов, который требует использования специального масс-спектрометра, называемого тандемным квадрупольным масс-спектрометром или трехквадрупольных масс-спектрометрами. В текущем исследовании мы систематически освещали основные шаги, связанные с выполнением успешного тандемного квадрупольного процесса протеомики на основе масс-спектрометрии с использованием ткани мозга человека с целью представления этого рабочего процесса более широкому исследовательской аудитории.
Introduction
В течение последнего десятилетия быстрое развитие масс-спектрометрии (МС) в сочетании с более глубокое понимание методов хроматографии значительно помогло в продвижении протеомики на основе РС. Методы, основанные на молекулярной биологии, такие как западное блоттинг и иммуногистохимия, уже давно страдают от проблем воспроизводимости, медленного времени обработки, изменчивости между наблюдателями и их неспособности точно количественно оценивать белки, и это лишь некоторые из них. С этой целью превосходная чувствительность высокопроизводительных подходов к протеомике продолжает предлагать молекулярным биологам альтернативный и более надежный инструмент в их стремлении лучше понять роль белков в клетках. Тем не менее, подходы к протеомике дробовика (Data dependent Acquisition или DDA) часто не могут обнаружить низкие обильные белки в сложных тканях, помимо того, что они в значительной степени зависят от чувствительности и разрешения инструмента. За последние пару лет лаборатории по всему миру разрабатывали такие методы, как Data Independent Acquisition (DIA), которые требуют увеличения вычислительной мощности и надежного программного обеспечения, которое может обрабатывать эти очень сложные наборы данных. Тем не менее, эти методы все еще находятся в процессе разработки и не очень удобны для пользователя. Целевые подходы протеомики на основе РС обеспечивают идеальный баланс между высокопроизводительный характер подходов к РС и чувствительностью подходов молекулярной биологии, таких как ИФА. Целевой эксперимент по протеомике на основе масс-спектрометрии фокусируется на обнаружении белков или пептидов, основанных на гипотезах, из экспериментов по протеомике на основе открытия дробовика или через доступную литературу1,2. Множественный мониторинг реакций (MRM) является одним из таких целевых подходов MS, который использует тандемный квадрупольный масс-спектрометр для точного обнаружения и количественной оценки белков / пептидов из сложных образцов. Метод предлагает более высокую чувствительность и специфичность, несмотря на необходимость использования инструмента с низким разрешением.
Квадруполь состоит из 4 параллельных стержней, каждый из которых соединен с диагонально противоположным стержнем. Флуктуирующее поле создается между квадрупольными стержнями путем подачи переменных напряжений ВЧ и постоянного тока. На траекторию ионов внутри квадруполя влияет наличие одинаковых напряжений на противоположных стержнях. Применяя радиочастотное напряжение к постоянному току, траектория ионов может быть стабилизирована. Именно это свойство квадруполя позволяет использовать его в качестве массового фильтра, который может избирательно пропускать определенные ионы. В зависимости от необходимости квадруполь может работать как в статическом, так и в сканирутном режиме. Статический режим позволяет проходить только ионам с заданным m/z, что делает режим очень селективным и специфичным для интересующих ионов. Режим сканирования, с другой стороны, позволяет проходить ионам во всем диапазоне m/z. Таким образом, тандемные квадрупольные масс-спектрометры могут работать 4 возможными способами: i) первый квадруполь, работающий в статическом режиме, а второй – в режиме сканирования; ii) первый квадруполь, работающий в режиме сканирования, а второй – в статическом режиме; iii) оба квадруполя, работающие в режиме сканирования; и iv) оба квадруполя, работающие в статическом режиме3. В типичном эксперименте MRM оба квадруполя работают в статическом режиме, что позволяет контролировать конкретные прекурсоры и их результирующие продукты после фрагментации. Это делает технику очень чувствительной и избирательной, что позволяет проводить точную количественную оценку.
Для молекулярных биологов ткань мозга человека и ее клетки являются сокровищницей. Эти замечательные единицы вечно интересного органа человеческого тела могут обеспечить молекулярное и клеточное понимание его функционирования. Протеомные исследования мозговой ткани могут не только помочь нам понять системное функционирование здорового мозга, но и клеточные пути, которые дисрегулируются при заболевании4. Однако мозговая ткань со всей ее неоднородностью является очень сложным органом для анализа и требует согласованного подхода для лучшего понимания изменений на молекулярном уровне. Следующая работа описывает весь рабочий процесс, начиная с извлечения белков из мозговой ткани, создания и оптимизации методов анализа MRM, до проверки целей(рисунок 1). Здесь мы систематически освещаем основные шаги, связанные с успешным экспериментом на основе MRM с использованием ткани человеческого мозга с целью представления техники и ее проблем более широкому исследовательской аудитории.
Protocol
Representative Results
Discussion
Такие методы, как иммуногистохимия и вестерн-блоттинг, считались золотыми стандартами для проверки белковых мишеней в течение многих лет. Эти методы находят применение даже сегодня с незначительными изменениями в протоколе и небольшой зависимостью от технологии, что делает их очень ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем проект MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), проект #34_IITB для SS и MASSFIITB Facility в IIT Bombay при поддержке Департамента биотехнологии (BT/PR13114/INF/22/206/2015) для проведения всех экспериментов, связанных с MS.
Мы выражаем особую благодарность г-ну Ришабу Ядаву за создание и редактирование всего видео и г-ну Нишанту Неруркару за его работу по редактированию аудио.
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| TSQ Altis mass spectrometer | Thermo | TSQ02-10002 | |
| uHPLC – Vanquish | Thermo | VQF01-20001 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 |
Referenzen
- Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions. Nature Methods. , (2012).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).
- Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
- Hosp, F., Mann, M. A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience. Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).
- Scopes, R. K. Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm. Analytical Biochemistry. , (1974).
- Kusebauch, U., et al. Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome. Cell. , (2016).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).
- Escher, C., et al. Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides. Proteomics. , (2012).
- Gillette, M. A., Carr, S. A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry. Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).
- Whiteaker, J. R., et al. A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma. Nature Biotechnology. , (2011).
- Hüttenhain, R., et al. Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics. Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).
- Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).
- Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits Aβ aggregation and toxicity. Biochemie. , (2001).
- Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia. Journal of Neurochemistry. , (2012).
- Liu, L. Y., et al. Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases. PLoS ONE. , (2012).
- Abbatiello, S., et al. New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins. Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).
